1、酵母發(fā)酵生物質(zhì)產(chǎn)生的生物乙醇是一種可再生的液體燃料，最有希望替代最終將被耗盡的化石能源，同時(shí)這也支持可持續(xù)發(fā)展。釀酒酵母被廣泛應(yīng)用于生物乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)。在釀酒酵母中有五個(gè)基因ADH1-ADH5 編碼與乙醇代謝相關(guān)聯(lián)的乙醇脫氫酶，其中的四種乙醇脫氫酶Adhlp，Adh3p，Adh4p和Adh5p在葡萄糖發(fā)酵過(guò)程中將乙醛還原為乙醇，而Adh2p則催化相反的反應(yīng)將乙醇氧化為乙醛。當(dāng)外界環(huán)境中的葡萄糖被耗盡后Adh2p負(fù)責(zé)催化利用乙醇作為碳源的

2、初始反應(yīng)。為構(gòu)建一株乙醇高產(chǎn)的釀酒酵母，嘗試通過(guò)基因敲除手段敲除ADH2來(lái)阻斷Adh2p催化的乙醇代謝支路通道來(lái)提高乙醇的產(chǎn)量。 分別從SGD和GenBank獲得ADH2和pUG6質(zhì)粒的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)嵌合引物以及六條驗(yàn)征引物。其中上下游嵌合引物的5'末端分別由45個(gè)與ADH2上下游同源的核苷酸組成；3'端則分別由19和22個(gè)與pUG6質(zhì)粒上的loxP-kanMX-loxP序列組件兩端同源的核苷酸組成。驗(yàn)證引物A，D分別位于ADH

3、2的上下游；B，C位于ADH2上；KB，KC則位于kanMX上。由嵌合引物通過(guò)擴(kuò)增pUG6質(zhì)粒中的loxP-kanMX-loxP序列組件產(chǎn)生ADH2基因敲除序列組件。將ADH2基因敲除序列組件轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞后，分別與ADH2序列上下游同源的45 bp序列將引發(fā)兩次同源重組事件，最終以loxP-kanMX-loxP取代基因組中的ADH2并賦予轉(zhuǎn)化子G418抗性。經(jīng)菌落PCR 驗(yàn)證為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化攜帶可賦予抗生素Zeoin抗性的bl