1、在植物基因工程的發(fā)展過程中，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是研究最清楚和應(yīng)用最廣泛的一種方法，因其費(fèi)用低、拷貝數(shù)低、重復(fù)性好、基因沉默現(xiàn)象少、轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)而備受科學(xué)工作者的青睞，因此，我們用這種技術(shù)研究了WRKY基因家族。目前有許多研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與了植物防御反應(yīng)，然而，有關(guān)特定WRKY蛋白在植物防御系統(tǒng)中作用的研究報(bào)道仍然是很少的。
　　本文從煙草中克隆了一個(gè)對煙草花葉病毒（Tobacco mo

2、saic virus，TMV）具有應(yīng)答的WRKY基因，它與其他植物中的WRKY40同源性較高，因此命名為NtWRKY40。為了解NtWRKY40基因的功能，本研究通過構(gòu)建35S:NtWRKY40過表達(dá)載體和RNAi-NtWRKY40抑制表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法獲得轉(zhuǎn)基因植株。分別在病毒侵染后的三個(gè)階段（6h、3d、9d）取非侵染葉，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測NtWRKY40基因以及病毒外殼蛋白基因（Coat Protein

3、,CP）和移動(dòng)蛋白基因（Move Protein,MP）的表達(dá)水平，結(jié)果表明：野生植株在侵染后6h和3d這兩個(gè)階段，NtWRKY40的表達(dá)僅升高了一兩倍，但侵染后9d，NtWRKY40的表達(dá)量顯著升高，達(dá)到一百五十多倍；而35S:NtWRKY40過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在病毒侵染后的三個(gè)時(shí)間段中，NtWRKY40的表達(dá)均沒有顯著變化。
　　為了研究病毒侵染后35S:NtWRKY40過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和野生植株中病毒的表達(dá)特點(diǎn)，分析NtWRK

4、Y40基因與感病程度的關(guān)系，我們分別以轉(zhuǎn)基因植株和野生植株病毒侵染后6h的病毒表達(dá)量為參照，分析侵染后3d和9d野生植株和轉(zhuǎn)基因植株中病毒基因CP和MP的表達(dá)變化，從我們的數(shù)據(jù)以及植物的感病情況可以得出，35S:NtWRKY40過表達(dá)植株對TMV的敏感性較野生型植株更強(qiáng)。由于目前所獲得的RNAi-NtWRKY40轉(zhuǎn)基因植株較少，還未進(jìn)行病毒侵染實(shí)驗(yàn)。通過上述結(jié)果可以推測NtWRKY40在煙草逆境應(yīng)答響應(yīng)中具有重要的作用，為進(jìn)一步研究該基

5、因的功能提供基礎(chǔ)。
　　在農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化過程中經(jīng)常出現(xiàn)多個(gè)T-DNA插入同一個(gè)位點(diǎn)和多插入位點(diǎn)的頻繁出現(xiàn)，這些T-DNA串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)基因的共抑制，甚至是基因沉默，從而影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，因此我們使用了一種高效準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，篩選和定量大量的轉(zhuǎn)基因植物株系中T-DNA的拷貝數(shù)和分析T-DNA串聯(lián)結(jié)構(gòu)。此外，我們還結(jié)合了多倍儀PCR方法，快速的克隆和分析串聯(lián)結(jié)構(gòu)間的填充DNA序列，序列分析表明，在直接串聯(lián)的T-D