1、本文分兩部分，第一部分：問號鉤端螺鉤體鞭毛相關(guān)基因原核表達系統(tǒng)的構(gòu)建和膜定位
　　 背景和目的：鉤端螺旋體(簡稱鉤體)病是由致病性鉤體引起的全世界流行的人獸共患病，鉤體的攜帶者主要是野生動物或家畜，尤其是嚙齒動物、有袋動物、牛、豬和狗。人感染鉤體后的臨床癥狀從輕微的癥狀到多器官衰竭，以黃疸、肺出血和腎衰竭為主要特征。肺彌漫性出血是一癥狀嚴重的的鉤體病，病死率高達25％。相反，大多數(shù)鉤體哺乳宿主動物如嚙齒類動物只呈現(xiàn)輕微的慢性疾病

2、或無癥狀感染，且通過尿液向外界終身排菌，造成此不同感染結(jié)局的差異至今還不清楚。鉤體病的致病因素如：脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、熱休克蛋白及鞭毛蛋白等可能與致病性有關(guān)，但確切的致病機制至今未明。已知不少病原菌主要通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)作用于宿主細胞，諸如黏附細胞、形成針形結(jié)構(gòu)向胞內(nèi)注入毒力因子、干擾及損傷細胞等。有文獻報道，鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白也經(jīng)T3SS分泌，某些鞭毛相關(guān)蛋白則是T3SS家族成員.近年發(fā)現(xiàn)問號鉤體具有較為完整的鞭毛組裝系統(tǒng)，相

3、關(guān)蛋白編碼基因連續(xù)排列在大染色體中形成毒力島樣結(jié)構(gòu)，其中鞭毛相關(guān)蛋白FliH、Flil、FliN和FliY等與鼠疫耶爾森菌T3SS的Ysc蛋白高度同源。因此，上述鞭毛相關(guān)蛋白在問號鉤體致病過程中的作用是有待于研究的重要課題。
　　 方法：以苯酚-氯仿法提取的問號鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組DNA為模板，用PCR擴增全長fliH、fil、fliN和fliY基因片段，T-A克隆后測序，繼而構(gòu)建上述目的基因克隆的原核表達系統(tǒng)。采用SD

4、S-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查重組蛋白rFliH、rFlil、rFliN和rFliY的表達情況，Ni-NTA親和層析法提純目的表達產(chǎn)物。皮下免疫家兔獲得4種目的重組蛋白抗血清，用ELISA和Western Blot分別檢測抗血清效價并了解抗血清與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力.采用免疫電鏡技術(shù)對FliH、Flil、FliN和FliY進行定位。
　　 結(jié)果：PCR擴增獲得大小分別為924、1365、318和1065bp的全長j

5、liH、fliI、fliN和fliY基因片段，與報道的序列比較，其核苷酸和氨基酸序列相似性均為100％。所構(gòu)建的原核表達系統(tǒng)均能有效地表達目的重組蛋白，其產(chǎn)量均約為20％。rFliH、rFliI、rFliN和rFliY蛋白免疫家兔后能產(chǎn)生抗體，其兔抗血清ELISA效價達到1：100000以上，并分別能識別相應(yīng)重組蛋白而出現(xiàn)明顯的Westem雜交條帶。FliH、FliI、FliN和FliY蛋白分布于問號鉤體內(nèi)膜外表面、外膜內(nèi)表面或內(nèi)外膜之

6、間。
　　 結(jié)論：本研究成功地構(gòu)建了能高效表達問號鉤體鞭毛相關(guān)蛋白FliH、FliI、FliN和FliY的原核表達系統(tǒng)，并獲得了能有效識別上述蛋白抗原的高效價抗血清。鞭毛相關(guān)蛋白FliH、Flil、FliN和FliY是問號鉤體內(nèi)膜或外膜蛋白成分。
　　 第二部分：應(yīng)用基因打靶技術(shù)構(gòu)建問號鉤端螺旋體fliH/I/N/Y基因突變體及其功能的初探
　　 背景和目的：鉤端螺旋體(簡稱鉤體)病是全世界流行的人獸共患病，致病

7、性鉤體侵入人體后能引起急性發(fā)熱和全身各系統(tǒng)的疾病。鉤體病的致病因素如：脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、熱休克蛋白及鞭毛蛋白等可能與致病性有關(guān)，但確切的致病機制至今未明。FliN和FliY都被注釋為鞭毛馬達開關(guān)蛋白，和鼠疫耶爾森菌yscQ基因有一定的相似性，且YscQ屬于耶爾森菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)，與細菌侵襲力相關(guān)，也與鞭毛的轉(zhuǎn)向相關(guān)。因此我們將FliN和FliY作為鉤體毒力研究的重點對象。而fliH注釋為鞭毛合成蛋白，與鼠疫耶爾森菌yscL基因的氨基

8、酸序列相似度很高，fliI與鼠疫耶爾森菌yscN基因同屬于ATP酶，耶爾森菌中YscL蛋白負調(diào)控YscN的ATPase的活性。因此我們希望通過研究FliH和FliI的關(guān)系，從而對該兩者的功能有初步的了解。
　　 方法：本研究通過插入amp基因構(gòu)建重組的基因打靶載體，經(jīng)電穿孔導(dǎo)入鉤體內(nèi)構(gòu)建突變體.用氨芐青霉素抗性、PCR法和Western blot鑒定突變株。針對FliN—、FliY_突變株，動力實驗檢測了突變株的運動能力；Fon

9、tana銀染法檢測了突變株的粘附能力；流式細胞術(shù)檢測了突變株和野生株的感染不同時間后的小鼠巨噬細胞的死亡情況；豚鼠攻擊實驗檢測了突變株和野生株的毒力。Machite green assay檢測了FliI的ATPase活性和FliH與FliI的相互作用，而實時熒光定量RT-PCR則檢測了FliH與FliI在FliH-突變株和野生株間表達情況的變化。
　　 結(jié)果：分別以FliH-、Flil、FliN-、FliY-突變株的DNA為模板

10、，經(jīng)PCR擴增均得到較原基因片段長954bp的片段，此即為插入amp基因的長度；同時突變株的Western blot結(jié)果也分別得到了FliH、FliI、FliN、FliY表達的陰性結(jié)果。由此證實分別構(gòu)建成功了以氨芐青霉素抗性基因(amp)為標記fliH、fliI、fliN和fliY基因敲除的鉤體突變株。FliN-、FliY-突變株的菌落比野生株的明顯小，表明失去運動能力。FliN-、FliY-突變株和野生株對J774A.1細胞的最大黏附

11、率分別為25.5％、22.9％和49.1％；三者誘導(dǎo)J774A.1細胞的最大凋亡率分別為29.7％、27.4％和48.2％。而豚鼠攻擊的致死劑量突變株也同樣明顯高于野生株，當注入6×109個野生株鉤體時，死亡率達到100％；當分別注入6×1010個FliN-、FliY-突變株鉤體時，死亡率才達到80％和60％.實驗證明了FliI的ATPase活性和FliH對FliI ATPase活性的抑制作用，在FliH—突變株中FliI的表達相較于野