1、本文主要從以下二部分展開： 第一部分、線粒體相關(guān)的非caspasc依賴途徑在問號鉤端螺旋體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡中的作用 研究目的： 在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，致病性問號鉤端螺旋體(簡稱鉤體)可以在體外誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞系J774A．1細(xì)胞凋亡，但是其具體的凋亡機(jī)制還未闡明。本研究的目的是探討線粒體相關(guān)途徑在問號鉤體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中的作用。 材料與方法： (1)建立致病性問號鉤體黃疸出血群賴型賴株體外誘

2、導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的模型：鉤體分別與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(MPMs)，小鼠單核巨噬樣細(xì)胞系J774A．1細(xì)胞，人單核樣細(xì)胞系THP-1細(xì)胞，共同孵育。采用AnnexinV—FITC和PI雙染法，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測鉤體感染后巨噬細(xì)胞凋亡率。(2)透射電鏡觀察誘導(dǎo)凋亡的巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，尤其是線粒體改變。(3)應(yīng)用活性檢測試劑盒測定鉤體感染后的巨噬細(xì)胞的caspase-8，caspase-9活性變化；非特異性Caspase阻斷劑對凋亡的影響；J

3、C-1染色后流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測線粒體膜電位(MPT)變化，應(yīng)用熒光探針DCFH—DA檢測細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平。(4)Westernblot分別檢測誘導(dǎo)鉤體感染后的巨噬細(xì)胞在感染不同時(shí)間后的線粒體或胞漿成份中的細(xì)胞色素C，EndoG，AIF和Smac的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用免疫熒光染色法檢測相應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)位。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔阻斷劑CsA預(yù)處理細(xì)胞后，對凋亡及線粒體釋放蛋白的影響。(5)應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測鉤體感染后的巨噬細(xì)胞的凋

4、亡相關(guān)基因Bcl-2家族的mRNA表達(dá)水平變化，對表達(dá)發(fā)生變化的及代表性Bcl-2家族基因的應(yīng)用Real—timePCR再次確認(rèn)mRNA水平變化。 結(jié)果： (1)成功建立致病性問號鉤體黃疸出血群賴型賴株體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的模型，顯示問號鉤體賴株可誘導(dǎo)3種巨噬細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率在一定范圍內(nèi)，隨著感染時(shí)間延長和感染菌量的增加而升高。但是感染菌量過高時(shí)，細(xì)胞凋亡率開始下降，同時(shí)細(xì)胞壞死率升高。(2)透射

5、電鏡結(jié)果顯示：感染問號鉤體后，3種巨噬細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征，例如染色質(zhì)濃縮和邊緣化，新月形核，細(xì)胞空泡化，細(xì)胞線粒體腫脹和嵴消失，但是3種被感染巨噬細(xì)胞的形態(tài)改變之間無明顯差異。(3)問號鉤體賴株感染3種巨噬細(xì)胞后，均可檢測到caspase-8活性明顯升高，caspase-9活性無明顯升高；但是非特異性caspase抑制劑不能完全阻斷細(xì)胞凋亡。被鉤體感染后，3種巨噬細(xì)胞線粒體膜電位均隨著感染時(shí)間的延長而逐漸下降。其中，MPMs的MP

6、T下降幅度大于J774A．1和THP-1細(xì)胞。此外，與正常對照細(xì)胞相比，被鉤體感染的3種巨噬細(xì)胞均出現(xiàn)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平升高。(4)WesternBlot顯示，在問號鉤體賴株誘導(dǎo)3種巨噬細(xì)胞凋亡的過程中，在MPMs和J774A．1細(xì)胞中檢測到AIF和EndoG從線粒體釋放到胞漿，在THP-1細(xì)胞中檢測到AIF從線粒體釋放到胞漿；但是未檢測到細(xì)胞色素C和Smac從線粒體釋放到胞漿。同時(shí)，免疫熒光染色證實(shí)鉤體感染后AIF或EndoG從

7、線粒體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。MPT阻斷劑可以部分性阻斷細(xì)胞凋亡，完全阻斷AIF或EndoG的釋放。(5)線粒體相關(guān)的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，Bcl-2家族的mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示：鉤體感染后3種巨噬細(xì)胞后，Bcl-2家族抗凋亡基因Bcl-2，Bcl—XL均無明顯變化，但是促凋亡基因Bid，Bik1，Bnip3，Bcor，Bcl-2l1和Bclaf1在MPMs和J774A．1細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，促凋亡基因Bid，Bik1，Bn

8、ip3，Bcl-2l1和Bcaf1在THP-1細(xì)胞中小幅上調(diào)，其他促凋亡基因無明顯變化。 結(jié)論： (1)致病性的問號鉤體黃疸出血群賴型賴株可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。 (2)問號鉤體賴株通過caspase依賴的caspase-8途徑和線粒體相關(guān)的非caspase依賴途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。 (3)Bcl-2家族在問號鉤體賴株誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中，一些促凋亡基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，可能參與凋亡的調(diào)控，具體機(jī)制有待

9、進(jìn)一步研究。 第二部分、中國致病性鉤端螺旋體ompL1基因的特點(diǎn)及OmpL1的交叉免疫性的研究 研究目的： 研究中國流行的致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)的ompL1基因的特點(diǎn)和分布，OmpL1蛋白的交叉免疫反應(yīng)性和免疫保護(hù)作用。 材料與方法： 將致病性鉤體，包括15株中國參考標(biāo)準(zhǔn)株和163株臨床分離株，分別提取基因組DNA，PCR法擴(kuò)增ompL1基因，測序并對核苷酸序列進(jìn)行比對和分子進(jìn)化樹分析，根據(jù)

10、分析結(jié)果對ompL1基因進(jìn)行分型。然后，通過構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并收獲重組OmpL1蛋白(rOmpL1)；以純化的人OmpLl蛋白免疫家兔后獲得抗rOmpL1的多克隆抗體。采用Westernblot和ELISA法鑒定表達(dá)的rOmpL1蛋白的免疫原性和免疫反應(yīng)性。應(yīng)用顯微鏡凝集試驗(yàn)(MAT)檢測兔抗rOmpL1抗體的交叉凝集效價(jià)，同時(shí)應(yīng)用鉤體細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測此抗體阻斷致病鉤體賴型賴株的細(xì)胞粘附作用。最后，以rOmpL1免疫豚鼠后，檢測對

11、不同ompL1基因型別的致病性鉤體感染的免疫保護(hù)作用。 結(jié)果： 全部被檢測鉤體菌株的基因組DNA都能擴(kuò)增出ompL1基因。根據(jù)鉤體標(biāo)準(zhǔn)株的ompL1基因核苷酸序列比對和序列特征的分析結(jié)果，將擴(kuò)增出的ompL1基因分成3型，即ompL1/1，ompL1/2和ompL1/3。通過原核系統(tǒng)表達(dá)的3種rOmpL1蛋白與鉤體病人血清可以發(fā)生免疫反應(yīng)。MAT試驗(yàn)中，兔抗rOmpL1的3種抗體與不同ompL基因型的鉤體菌株之間可以產(chǎn)生

12、廣泛和明顯的交叉凝集反應(yīng)。同時(shí)，使用rOmpL1蛋白作為包被抗原的ELISA法，進(jìn)一步驗(yàn)證了3種rOmpL1蛋白與鉤體病病人血清樣本之間同樣可以發(fā)生交叉免疫反應(yīng)。3種兔抗rOmpL1抗血清均能抑制致病性問號鉤體賴型賴株粘附J774A．1細(xì)胞。此外，3種rOmpL1蛋白免疫豚鼠后，對來自不同ompL1基因類型的致病性鉤體的感染具有交叉免疫保護(hù)作用。 結(jié)論： 中國流行的致病性鉤體的ompL1基因可以分成ompL1/1，omp