1、研究背景鉤端螺旋體病是一種世界范圍傳播的動物源性疾病，其病原體為鉤端螺旋體（簡稱鉤體），屬于鉤端螺旋體屬。除了南極洲外，幾乎所有的洲均發(fā)現(xiàn)了該病原菌的存在，尤其是熱帶和亞熱帶國家。嚙齒類動物、豬和狗等是其主要的儲存宿主。鉤體可通過這些宿主的尿液排到外界，人類主要通過接觸這些污染的水源和土壤而引起急、慢性感染，臨床癥狀表現(xiàn)為輕微的“流感樣”癥狀到嚴(yán)重的肺部出血和腎功能衰竭，直至死亡。目前問號狀鉤端螺旋體至少可分為25個血清群、260多血清

2、型，我國已發(fā)現(xiàn)了19個血清群、161個血清型。
　　在鉤體感染的早期，機(jī)體的天然免疫在清除鉤體的過程中發(fā)揮了重要作用，鉤體可被組織或血液中的單核-巨噬細(xì)胞所吞噬。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的模式受體—清道夫受體A(scavengerreceptor，SR-A)在機(jī)體抗外來微生物的感染過程中發(fā)揮了非常重要的作用。LPS、脂蛋白和磷壁酸等細(xì)菌組分或完整的細(xì)菌均可以與SR-A相互作用。然而，至今未見鉤體與巨噬細(xì)胞SR-A相互作用的研究報道。

3、r>　　研究方法本課題主要以原代小鼠巨噬細(xì)胞、鼠巨噬細(xì)胞系和問號鉤體56606v株為主要研究對象，研究鉤體56606v株與巨噬細(xì)胞相互作用過程中，是否通過SR-A被巨噬細(xì)胞所識別、粘附和吞噬，尋找鉤體何種組分參與了SR-A作用以及SR-A和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的變化，探究鉤體與SR-A作用后吞噬途徑。步驟如下:首先，Real-time PCR檢測鉤體感染原代和傳代鼠巨噬細(xì)胞后，SR-A及IL-6、TNF-α和IFN-β1 mRNA的變

4、化。其次，通過特異性化學(xué)抑制劑polyⅠ和SR-A單克隆抗體(2F8)抑制原代鼠腹腔巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞粘附吞噬鉤體比率。第三，將鼠SR-AⅠ和SR-AⅡ連接pDS-Red2-N1上，轉(zhuǎn)染至非吞噬細(xì)胞—中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1，G418篩選出高表達(dá)的pDS-Red2-N1-SR-A-CHO-K1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。將穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株與鉤體56606v株相互作用，檢測其粘附吞噬鉤體情況。第四，應(yīng)用SR-A基因敲除小

5、鼠腹腔巨噬細(xì)胞與鉤體相互作用，檢測細(xì)胞粘附吞噬鉤體的變化，確認(rèn)SR-A介導(dǎo)鉤體進(jìn)入巨噬細(xì)胞，激活機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)。
　　另外，熱酚水法提取并純化鉤體LPS，鱟試驗對其定量后，用不同濃度的鉤體LPS刺激SR-A轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測鉤體LPS刺激后的pDS-Red2-N1-SR-AⅠ/Ⅱ-CHO-K1對FITC標(biāo)記的beads吞噬情況。同時，將純化后的鉤體LPS刺激原代和傳代鼠巨噬細(xì)胞，Real-timePCR檢測

6、SR-A及IL-6、TNF-α和IFN-β1 mRNA的變化。
　　最后，通過Pull down方法檢測鉤體感染pDS-Red2-N1-SR-AⅡ-CHO-K1后，細(xì)胞GTPase Rac和GTPase Cdc42蛋白活性的變化，探究鉤體、SR-A和Rac/Cdc42吞噬作用途徑。
　　結(jié)果 Real-time PCR檢測到鉤體56606v株感染RAW264.7細(xì)胞后，SR-A和IL-6 mRNA表達(dá)顯著增加。用原代鼠腹腔巨

7、噬細(xì)胞替代RAW264.7細(xì)胞，也可得到相同的實驗結(jié)果，暗示著在鉤體感染過程中，SR-A可能參與了巨噬細(xì)胞的吞噬作用和機(jī)體的炎癥反應(yīng)。用特異性化學(xué)抑制劑PolyⅠ和SR-A單克隆抗體作用于巨噬細(xì)胞;結(jié)果顯示，在缺乏血清補(bǔ)體調(diào)理的情況下，兩者均能有效抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬CFSE標(biāo)記的鉤體，尤其是對4％多聚甲醛滅活的鉤體，抑制作用則更為明顯，抑制率最高可達(dá)50％左右。通過將鼠SR-AⅠ/Ⅱ連接到pDS-Red2-N1真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至非

8、吞噬細(xì)胞CHO-K1，G418篩選后得到了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，同pDS-Red2-N1-CHO-K1相比，pDS-Red2-N1-SR-A-CHO-K1能顯著增加粘附吞噬鉤體比率(P＜0.05），pDS-Red2-N1-SR-AⅠ-CHO-K1和pDS-Red2-N1-SR-AⅡ-CHO-K1粘附吞噬鉤體比率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05）。為確證上述實驗結(jié)果，我們應(yīng)用SR-A基因敲除的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞粘附吞噬鉤體，同樣

9、證實了SR-A-/-巨噬細(xì)胞粘附吞噬鉤體的比率低于正常對照組，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05）。
　　熱酚水法提取并純化鉤體LPS經(jīng)考馬斯亮藍(lán)及銀染染色，未見明顯的細(xì)菌蛋白雜帶，且LPS大小位于15kDa-25kDa之間。提純的鉤體56606v株LPS定量檢測后，不同濃度鉤體LPS(250ng/ml和500ng/ml)刺激pDS-Red2-N1-SR-AⅠ/Ⅱ-CHO-K1，能顯著增加細(xì)胞對Latex beads吞噬能力。用鉤體L

10、PS刺激原代鼠腹腔巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞，均可檢測到SR-A mRNA有顯著增加，且有一定劑量依賴性。同時，IL-6、TNF-α和IFN-β1等重要細(xì)胞因子mRNA顯著增加。
　　Pull down檢測結(jié)果表明，鉤體感染pDS-Red2-N1-SR-AⅡ-CHO-K1后，細(xì)胞GTPase Rac和GTPase Cdc42蛋白表達(dá)增加，而對照組未見明顯變化。
　　結(jié)論小鼠巨噬細(xì)胞能通過SR-A粘附吞噬鉤體56606v株

11、;SR-A在巨噬細(xì)胞與鉤體作用過程中主要發(fā)揮吞噬功能。鉤體LPS能夠被SR-A識別結(jié)合，且能夠刺激巨噬細(xì)胞SR-A mRNA表達(dá)增加，IL-6、TNF-α和IFN-β1等細(xì)胞因子mRNA出現(xiàn)不同程度的變化。鉤體感染細(xì)胞后，GTPaseRac和GTPase Cdc42蛋白表達(dá)增加。這些結(jié)果表明在鉤體感染過程中，巨噬細(xì)胞通過SR-A粘附吞噬鉤體并激活下游的Rac和Cdc42吞噬途徑。鉤體LPS參與了SR-A的識別結(jié)合作用，激活了機(jī)體的天然免