1、目的：致病性鉤端螺旋體（簡稱鉤體）感染引起的鉤體病是全球流行的自然疫源性人獸共患傳染病，也是我國重點防疫和監(jiān)控的主要傳染病之一。致病性鉤端螺旋體有7個基因種(genospecies)，但問號鉤體（Leptospira interrogans）是包括我國在內(nèi)的大多數(shù)國家或地區(qū)優(yōu)勢流行的基因種，約70％我國鉤體病患者為感染問號鉤體黃疸出血群賴型所致。問號鉤體感染動物后通常無癥狀或癥狀輕微，但可長期從尿液排出，污染自然水體形成傳染源（疫水），

2、人接觸疫水感染后均發(fā)病。問號鉤體具有強大的侵襲力，能迅速穿越黏膜或破損皮膚侵入宿主后進入血流，引起流感傷寒型鉤體病，然后穿越小血管播散至肺、肝、腎及腦脊液等臟器或組織，分別引起肺出血及肺彌漫性出血型、黃疸出血型、腎型或腦膜腦炎型鉤體病，重癥鉤體病患者病死率可高達30～50％。眾所周知，侵襲性酶類是決定病原菌侵襲能力的毒力因子。問號鉤體黃疸出血群賴型賴株（國內(nèi)編號56601）基因組中LA0948、LA3400、LA3401基因產(chǎn)物被注釋為

3、鋅依賴肽酶(Zn2+-dependentpeptidase)，但其功能及其致病作用迄今無研究報道。金屬蛋白酶(metalloprotease，MP)也是一類鋅依賴蛋白水解酶，胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分子是其主要水解底物。
　　因此，確定問號鉤體56601株LA0948、LA3400、LA3401基因產(chǎn)物是否具有MP功能及其在問號鉤體感染過程中的作用，對于闡明問號鉤體侵襲力物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制具有

4、重要意義。
　　方法:采用生物信息學(xué)專用軟件分析問號56601株LA0948、LA3400、LA3401基因結(jié)構(gòu)及其功能結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建問號鉤體56601株LA0948、LA3400、LA3401基因原核表達系統(tǒng)，Ni-NTA親和層析法提純重組表達產(chǎn)物rLA0948、rLA3400、rLA3401，采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測其表達及提純效果。純化的rLA0948、rLA3400、rLA3401皮內(nèi)注射免疫

5、家兔獲得抗血清，采用飽和硫酸胺沉淀聯(lián)合DEAE-52離子交換層析法獲得其IgG。采用偶氮底物紫外分光光度法，測定rLA0948、rLA3400、rLA3401水解偶氮酪蛋白活性及其Km和Kcat值、同時確定其水解底物時最適pH、溫度、金屬離子種類。采用SDS-PAGE法，檢測rLA0948、rLA3400、rLA3401水解多種ECM分子的活性。另采用偶氮底物紫外分光光度法及多種蛋白酶抑制劑、金屬離子螯合劑，進一步證實rLA0948、r

6、LA3400、rLA3401水解偶氮酪蛋白的活性。采用實時熒光定量RT-PCR和Western blot法，分別檢測問號鉤體56601株感染HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細胞或HEK293人胚腎上皮細胞后LA0948、LA3400、LA3401基因mRNA水平及其產(chǎn)物外分泌情況。構(gòu)建問號鉤體56601株LA0948、LA3400、LA3401基因敲除突變株ΔLA0948、ΔLA3400、ΔLA3401。采用Transwell法，檢測ΔLA094

7、8、ΔLA3400、ΔLA3401突變株及其野生株穿越HUVEC或HEK293細胞單層的能力及其差異。采用問號鉤體金地鼠感染模型，了解ΔLA0948、ΔLA3400、ΔLA3401突變株及其野生株感染動物后內(nèi)臟播散、尿液排菌、引起組織病變的能力及其差異。
　　結(jié)果:生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，問號鉤體56601株LA0948、LA3400、LA3401基因均有M16家族鋅離子依賴基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotea

8、se，MMP)酶功能結(jié)構(gòu)域，但僅LA0948和LA3401基因有明確的MMP基序HXXEH（HFLEX和HLLEH）。所構(gòu)建的LA0948、LA3400、LA3401基因原核表達系統(tǒng)均能有效表達目的重組蛋白rLA0948、rLA3400、rLA3401，Ni-NTA親和層析法提取的rLA0948、rLA3400、rLA3401經(jīng)SDS-PAGE后均顯示為單一蛋白條帶。
　　rLA0948、rLA3400、rLA3401均能水解偶氮

9、酪蛋白以及ECM分子膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型)、纖維連接蛋白（fibronectin）、層粘連蛋白(laminin)、核心蛋白多糖(decorin)。rLA0948、rLA3400、rLA3401水解偶氮酪蛋白Km和Kcat值分別為123.1785μmol·L-1和5.987 s-1、742.7561μmol·L-1和24.113 s-1、340.1358μmol·L-1和17.676 s-1，水解時最適pH為7.4、最適溫度為37℃

10、。6種金屬離子中，Zn2+、其次是Mg2+能增強rLA0948、rLA3400、rLA3401水解偶氮酪蛋白活性。各種蛋白酶抑制劑均可抑制rLA0948、rLA3400、rLA3401水解偶氮酪蛋白活性，但以苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制作用最強，其酶活性也可被金屬離子螯合劑所抑制。因此，rLA0948、rLA3400、rLA3401均為金屬蛋白酶，分別命名為L-MP1、L-MP2、L-MP3。
　　問號鉤體56601株感染HUVE

11、C或HEK293細胞后L-MP1-mRNA、L-MP2-mRNA、 L-MP3-mRNA水平顯著升高(p＜0.05)并外分泌。ΔLA0948和ΔLA3401突變株穿越HUVEC或HEK293細胞單層的能力顯著低于野生株(p＜0.05)，ΔLA3400突變株穿越HUVEC或HEK293細胞單層的能力雖低于野生株，但無顯著性差異(p＞0.05)。ΔLA0948、ΔLA3400、ΔLA3401突變株感染的金地鼠肺、肝、腎組織以及尿液中鉤體數(shù)量