1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是芽孢桿菌屬中的一種，為革蘭氏陽性菌，細胞壁不含內(nèi)毒素，能形成芽孢，被FDA認為是安全菌株(GRAS)，是目前廣泛應(yīng)用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌之一。
　　枯草芽孢桿菌作為宿主菌的優(yōu)勢體現(xiàn)在擁有一套高效的蛋白分泌系統(tǒng)，這有利于胞外蛋白的分泌，十分適合蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。不足之處在于枯草芽孢桿菌產(chǎn)生大量蛋白酶，對外源蛋白造成嚴重的降解。利用基因工程的方法優(yōu)化改造枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)以獲得優(yōu)

2、良的酶工程菌是目前頗為重要的方向。由于外源蛋白在該系統(tǒng)的分泌一般需要枯草芽孢桿菌自身信號肽的引導，而目的蛋白與信號肽之間存在適配性問題，因此針對特定的目的蛋白需要一套信號肽篩選系統(tǒng)以獲得最適信號肽，另一方面，枯草芽孢桿菌在對數(shù)生長末期會產(chǎn)生大量的蛋白酶，包括胞外蛋白酶以及胞內(nèi)蛋白酶，關(guān)于降低胞外酶活的研究，已取得長足的發(fā)展，而對于胞內(nèi)酶的研究鮮少涉及。
　　本研究的第一部分首先選取實驗室前期獲得的兩個酶基因：溶解性多糖單加氧酶 C

3、BP21和N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯降解酶AiiO-AIO6作為目的蛋白，以pWB980為基本骨架，通過無縫克隆等新型分子克隆手段，將信號肽添加至目的蛋白上游，從而構(gòu)建了一系列信號肽篩選載體，并在枯草芽孢桿菌168中實現(xiàn)分泌表達。重組菌在SR培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，分析上清液中目的蛋白在重組菌中的表達情況。結(jié)果顯示：YlqB對溶解性多糖單加氧酶CBP21的引導分泌能力最強。而N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯降解酶AiiO-AIO6不需要枯草芽孢桿菌自身信號

4、肽的引導，能自行分泌至胞外。
　　本研究的第二部分，以兩種絲氨酸水解酶基因YlbL和 AprX，半胱氨酸水解酶基因YwpE，金屬酶基因AmpS作為被敲除的靶基因，采用插入失活敲除靶基因的方法，構(gòu)建了胞內(nèi)蛋白酶敲除株△YlbL、△AprX、△YwpE、△AmpS，并將前期構(gòu)建的表達溶解性多糖單加氧酶CBP21和N-?；呓z氨酸內(nèi)酯降解酶AiiO-AIO6的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入敲除株，在SR培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，初步分析發(fā)現(xiàn)：與野生型菌株相比

5、△AprX、△YwpE、△AmpS均能使溶解性多糖單加氧酶 CBP21和N-?；呓z氨酸內(nèi)酯降解酶AiiO-AIO6產(chǎn)量提高，而在敲除株△YlbL中，檢測不到溶解性多糖單加氧酶CBP21的表達，N-?；呓z氨酸內(nèi)酯降解酶AiiO-AIO6產(chǎn)量較野生型的也有顯著提高。通過對枯草芽孢桿菌表達外源蛋白的研究發(fā)現(xiàn)：以溶解性多糖單加氧酶和N-?；呓z氨酸內(nèi)酯降解酶為例，不同目的蛋白在枯草芽孢桿菌的分泌表達機制差異極大，其中溶解性多糖單加氧酶CBP