1、第一部分以Candidasp．尿酸酶為模型考察用積分法測(cè)定米氏常數(shù)(Michaelis-Mentenconstant，Km)及黃嘌呤對(duì)其抑制常數(shù)(inhibitionconstant，Ki)所需條件。用293nm吸收變化記錄尿酸酶反應(yīng)，用積分法確定表觀米氏常數(shù)(apparentMichaelis-Mentenconstant，Kmapp)和表觀最大反應(yīng)速度(apparentmaximalreactionrate，Vmapp)。據(jù)上述參數(shù)

2、隨抑制劑濃度的變化確定抑制類型和Ki。被分析數(shù)據(jù)中的畸異值顯著降低結(jié)果可靠性。通常終點(diǎn)底物濃度小于1／6Kmapp而起始底物濃度足夠高，此積分法測(cè)定Kmapp的偏差和變異小于20％而Vmapp精度更高。用積分法所得Kmapp與雙倒數(shù)法一致，且和黃嘌呤濃度成正比，對(duì)應(yīng)Ki為(5．4±0．8)μmol／L(n=3)，也與雙倒數(shù)法一致。被分析數(shù)據(jù)精度足夠高，用無抑制劑~l'Km的4倍以上起始底物濃度，并固定終點(diǎn)底物濃度小于1／6Km，此積分法

3、能高效且低成本篩選特殊類型的抑制劑。 第二部分以Bacillusfastidiosus胞外尿酸酶為模型考察用簡化積分法測(cè)定較低底物濃度測(cè)定黃嘌呤Ki的可靠性。用簡化積分速度方程擬合反應(yīng)過程確定Vm／Km，據(jù)Km／Vm隨黃嘌呤濃度的變化確定Ki，同時(shí)用測(cè)定半抑制濃度法測(cè)定黃嘌呤對(duì)其Ki。兩種方法所得結(jié)果均與雙倒數(shù)法無統(tǒng)計(jì)差異，但簡化積分法成本低，抗干擾能力更強(qiáng)。在實(shí)踐中對(duì)于已知抑制類型抑制劑及其類似物，可據(jù)定量方法靈敏度與Km的

4、相對(duì)大小選擇測(cè)定抑制效力的方法；反應(yīng)不可逆且可連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)曲線時(shí)，在較低底物濃度下用簡化積分法篩選抑制劑更便于常規(guī)實(shí)踐。 第三部分以谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)硫酶(glutathione-S-transferase,GST)為模型，考察用積分法測(cè)定有產(chǎn)物抑制的不可逆酶反應(yīng)體系底物含量的可靠性，及積分法結(jié)合經(jīng)典初速度法測(cè)定酶活性的可靠性。測(cè)定340am吸收監(jiān)測(cè)反應(yīng)。優(yōu)化參數(shù)后此積分法所得產(chǎn)物最大吸收和酶活性對(duì)分析數(shù)據(jù)起止點(diǎn)的變化不敏感，且

5、有很寬的線性響應(yīng)范圍。故只要獲得不可逆酶反應(yīng)體系積分速度方程和有效參數(shù)，有產(chǎn)物抑制時(shí)此積分法仍能用于動(dòng)力學(xué)酶法分析和測(cè)定酶活性。積分法結(jié)合經(jīng)典初速度法測(cè)定酶活性可有效拓展線性響應(yīng)范圍。用積分法進(jìn)行動(dòng)力學(xué)酶法分析方法效率高，成本低，抗干擾能力強(qiáng)，上限高于工具酶Km，甚至可高于儀器可測(cè)上限。此積分法用于酶法分析具有一定普遍性和應(yīng)用價(jià)值。 第四部分以酵母醇脫氫酶(Dehydrogenases,ADH)為模型，考察用積分法測(cè)定有產(chǎn)物抑