1、目的：
　　異常血管新生是糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變的典型的病理現(xiàn)象，其發(fā)生機(jī)制至今尚不完全清楚。既往已經(jīng)證實(shí)過(guò)表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是早期糖尿病腎病和視網(wǎng)膜異常血管新生的重要驅(qū)動(dòng)因素。VEGF能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移和成管，并增加血管的通透性。阻止VEGF的分泌和活性增加能有效減輕腎小球肥大、減輕腎小球基底膜的增厚以及減少尿蛋白的排泄，但臨床研究證實(shí)VEGF單抗治療糖尿病會(huì)引起許多不良反應(yīng)，如腎血栓性微血管病、血壓

2、增高和蛋白尿增多。因此，需要繼續(xù)研究糖尿病血管新生的發(fā)病機(jī)制并找到有效的治療靶點(diǎn)和治療策略。
　　分泌型糖蛋白Slit2及其受體Robo最初作為一類(lèi)重要的神經(jīng)元軸突導(dǎo)向因子被發(fā)現(xiàn)。隨著對(duì)Slit-Robo信號(hào)通路作用機(jī)制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該信號(hào)通路還參與血管新生（包括腫瘤）、炎癥、白細(xì)胞趨化及血管滲漏等過(guò)程。如在腫瘤、子宮內(nèi)膜異位和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)滑膜炎的血管生成中起著促進(jìn)的作用。尤其有研究報(bào)道Slit2/Robo1信號(hào)通路參與了糖

3、尿病視網(wǎng)膜病變的病理血管生成，但該這信號(hào)通路是否參與糖尿病腎病腎小球病理性血管生成未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本課題首先觀察早期糖尿病腎病Slit2-Robo1信號(hào)通路的表達(dá)，探討該通路蛋白與血管新生和蛋白尿等指標(biāo)的相關(guān)性;接下來(lái)在體外建立模擬體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，構(gòu)建不含Slit2的高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基（目的是去除系膜細(xì)胞源性Slit2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞Slit2/Robo1信號(hào)通路的影響），將該條件培養(yǎng)基作用于培養(yǎng)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，觀察該高

4、糖條件培養(yǎng)基能否激活腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中的Slit2/Robo1信號(hào)通路，而且該通路激活后是否促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管等血管新生活動(dòng)。旨在闡明Slit2-Robo1信號(hào)通路在糖尿病腎小球內(nèi)皮血管新生的作用機(jī)制，為糖尿病腎病病理性血管新生的防治尋找新的方向。
　　方法：
　　我們的實(shí)驗(yàn)包括組織實(shí)驗(yàn)研究和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究?jī)刹糠帧?br>　　第一部分：Slit2/Robo1信號(hào)通路蛋白在早期糖尿病腎病腎小球中的表達(dá)及意義。

5、>　　1.收集病理符合Tervaert's糖尿病腎病病理分型Ⅰ-Ⅱa期，且患者24h尿蛋白大于30mg小于500mg，eGFR大于90mL/min/1.73m2等早期糖尿病腎病納入標(biāo)準(zhǔn)的19例Ⅱ型糖尿病DN標(biāo)本，對(duì)照組為正常的癌旁腎組織病人(n=15)。
　　2.免疫組化染色Slit2、Robo1和CD31在糖尿病腎病腎小球中的表達(dá)變化。
　　3.相關(guān)性分析Slit2/Robo1信號(hào)通路蛋白和CD31蛋白、24h蛋白尿等臨床

6、指標(biāo)的關(guān)系。
　　第二部分：高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞Slit2-Robo1信號(hào)通路的影響及其與血管新生的關(guān)系。
　　1.高糖對(duì)培養(yǎng)人系膜細(xì)胞Slit2分泌的影響。細(xì)胞分別用5.5mM葡萄糖DMEM培養(yǎng)基、33mM葡萄糖DMEM培養(yǎng)基、33mM葡萄糖+Slit2siRNA DMEM培養(yǎng)基和5.5mM葡萄糖+Slit2siRNA DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。免疫印跡、定量實(shí)時(shí)PCR和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢查Sl

7、it2在人腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.制備人腎小球系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基：人腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)于33mM葡萄糖+Slit2siRNA DMEM培養(yǎng)基或5.5mM葡萄糖+Slit2siRNA DMEM培養(yǎng)基。48小時(shí)后，收集該培養(yǎng)基，與內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基按體積1∶1混合構(gòu)建為人腎小球系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基（糖濃度通過(guò)添加葡萄糖維持以前的濃度）。
　　3.高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞Slit2-Robo1信號(hào)通路分子表達(dá)的時(shí)間

8、依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)。免疫印跡和定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Slit2/Robo1、PI3K/Akt和HIF-1α/VEGF信號(hào)通路蛋白在33mM高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用0、6、12、24和48h后的表達(dá)變化，旨在篩選出最佳時(shí)間點(diǎn)作為下步阻斷實(shí)驗(yàn)。
　　4.Robo1基因沉默后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/Akt和HIF-1α/VEGF信號(hào)通路蛋白的影響。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于33mM組、33mM+Control siRNA組和33mM+Robo1siRNA組24h

9、，再用免疫印跡和定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)各蛋白的表達(dá)。
　　5.PI3K抑制劑對(duì)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路蛋白的影響。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于33mM組和33mM+LY294002（PI3K抑制劑）組24h，再用免疫印跡和定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)各蛋白的表達(dá)。
　　6.分別用細(xì)胞流式、CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合試驗(yàn)、Transwell遷移試驗(yàn)和內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用(24h)下Robo1基因沉默和PI3K抑制對(duì)內(nèi)皮

10、細(xì)胞增殖、遷移和成管的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　1.腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞均可見(jiàn)Slit2和Robo1表達(dá);
　　2.與正常腎組織相比，早期DN腎小球Slit2/Robo1組化染色強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，提示早期DN腎小球Slit2/Robo1信號(hào)途徑被活化。
　　3.Slit2和Robo1蛋白的表達(dá)量分別與CD31蛋白表達(dá)量成正相關(guān)，也與早期DN的24h尿蛋白成正相關(guān)，提示Slit2/Robo1信號(hào)途徑可

11、能參與了早期DN腎小球中的病理性血管生成，啟動(dòng)微白蛋白尿的發(fā)生。
　　第二部分：
　　1.高糖可刺激系膜細(xì)胞大量分泌Slit2蛋白，該高表達(dá)的slit2可能是系膜細(xì)胞幫助腎小球內(nèi)皮血管新生的主要原因之一;
　　2.高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基能活化腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中的Slit2/Robo1、PI3K/Akt和HIF-1α/VEGF信號(hào)通路，該作用呈時(shí)間依賴(lài)性。
　　3.阻斷Robo1能抑制PI3K/Akt和HIF-1α/

12、VEGF信號(hào)通路的激活;抑制PI3K能壓制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路激活。
　　4.高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基能促進(jìn)人腎小球細(xì)胞的增殖、遷移和成管。阻斷Robo1和抑制PI3K均能抑制能高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基的促血管生成作用。
　　結(jié)論：
　　1.Slit2/Robo1信號(hào)途徑可能參與了早期DN腎小球中的病理性血管新生，與微量白蛋白尿的發(fā)生有關(guān);
　　2.高糖可刺激系膜細(xì)胞大量分泌Slit2蛋白，該高表達(dá)的Sli

13、t2可能是系膜細(xì)胞幫助腎小球內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的主要原因之一;
　　3.高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基能活化腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中的Slit2/Robo1、PI3K/Akt和HIF-1α/VEGF信號(hào)通路，該作用呈時(shí)間依賴(lài)性;
　　4.高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基能促進(jìn)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管;阻斷Robo1和抑制PI3K均能抑制高糖系膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基的促內(nèi)皮細(xì)胞血管生成作用。這些結(jié)果提示Slit2/Robo1信號(hào)通路可能成為干擾和治療