1、一、研究背景和目的
　　 系統(tǒng)性硬皮?。⊿Sc）是一種病因不明、發(fā)病機(jī)制尚不明確、涉及多因素的復(fù)雜性疾病，臨床上主要以皮膚和內(nèi)臟器官纖維化、血管異常病變和免疫系統(tǒng)異常為主要特點(diǎn)的自身免疫性結(jié)締組織病。其中纖維化是系統(tǒng)性硬皮病發(fā)病過(guò)程中最突出的特點(diǎn)，也是嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量、甚至危及病人生命的主要威脅。在以往的研究中，系統(tǒng)性硬皮病的發(fā)病機(jī)理主要涉及纖維化、血管病變、免疫系統(tǒng)異常、雙胞胎研究、遺傳、種族、嵌合體等多個(gè)方面，也涉及了基

2、因芯片、蛋白芯片等技術(shù)在基因組范圍內(nèi)進(jìn)行研究，但均未能成功的解釋其發(fā)病機(jī)理。
　　 MircoRNAs (miRNAs)是存在于許多生物體內(nèi)長(zhǎng)約18～25 nt的一類短序列、非編碼、具調(diào)控功能的單鏈小分子RNA，幾乎參與所有生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化與凋亡，物質(zhì)代謝等。目前已經(jīng)明確，miRNAs是通過(guò)與其靶mRNA分子的3′端非編碼區(qū)(3′-UTR) 互補(bǔ)結(jié)合，在翻譯水平上特異性抑制基因表達(dá)，在許多

3、疾病的發(fā)病中扮演著重要角色。mircoRNA 芯片是近年來(lái)出現(xiàn)的發(fā)展比較成熟的高通量基因芯片技術(shù)，能在特定的時(shí)間點(diǎn)篩選出患者與正常人之間的差異microRNA表達(dá)情況，已在不少?gòu)?fù)雜性疾病的研究中得到了廣泛的應(yīng)用，特別是惡性腫瘤的研究中應(yīng)用最為廣泛。目前多個(gè)研究已經(jīng)證實(shí)microRNA與腫瘤的發(fā)病、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及銀屑病、系統(tǒng)紅斑狼瘡、惡性黑素瘤等疾病的發(fā)病密切相關(guān)，并找到了疾病特異性microRNA，如miR-203是銀屑病特異性micr

4、oRNA，miR-140與骨肉瘤密切相關(guān)等。SSc作為一種復(fù)雜性自身免疫性疾病，與腫瘤、銀屑病、系統(tǒng)紅斑狼瘡有類似的地方，因此，我們推測(cè)在其發(fā)病機(jī)制中很可能也有其發(fā)病相關(guān)的microRNA。
　　 本研究用microRNA 芯片技術(shù)和生物信息學(xué)的方法，在國(guó)內(nèi)外首次對(duì)系統(tǒng)性硬皮病患者皮損和正常人皮膚中的差異microRNA 進(jìn)行分析篩選，并對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行初步的分析和預(yù)測(cè)，以期獲得與系統(tǒng)性硬皮病發(fā)病關(guān)系密切相關(guān)或特異性的microR

5、NA，為進(jìn)一步研究microRNA在系統(tǒng)性硬皮病發(fā)病中的分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)記與治療靶點(diǎn)提供重要參考。二、對(duì)象與方法將研究對(duì)象分為SSc組和對(duì)照組。SSc組的納入標(biāo)準(zhǔn)為：符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)關(guān)于系統(tǒng)性硬皮病的診斷標(biāo)準(zhǔn)、發(fā)病較早（<2年）且未經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期系統(tǒng)激素治療（激素應(yīng)用<3個(gè)月）、有全身皮膚的硬化及肺纖維化的證據(jù)但臨床癥狀不明顯的患者，正常對(duì)照組為包皮環(huán)切患者的皮膚或良性皮膚痣切除術(shù)患者邊緣的正常皮膚；分別切取足量皮膚，提取總RNA，

6、分離microRNA 并進(jìn)行熒光標(biāo)記；然后進(jìn)行雜交、清洗，之后進(jìn)行microRNA芯片掃描；掃描結(jié)果用LuxScan3.0圖像分析軟件和SAM2.1軟件進(jìn)行差異microRNA的分析篩選；Real-time PCR 方法隨機(jī)驗(yàn)證篩選出的差異表達(dá)microRNA，以確保芯片結(jié)果的可靠性。
　　 生物信息學(xué)分析過(guò)程：首先，建立重點(diǎn)靶基因篩選庫(kù)；其次，在microRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)中（TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行其靶基因（mRNA）

7、的搜索獲得其功能注釋；第三，將搜索到的靶基因與重點(diǎn)靶基因篩選庫(kù)的基因進(jìn)行比對(duì)，挑選出功能上與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、纖維化、血管異常、免疫異常等相關(guān)以及存在于重點(diǎn)靶基因篩選庫(kù)中的基因，作為重點(diǎn)靶基因；第四，登錄NCBI 網(wǎng)站，將重點(diǎn)靶基因與SSc 輸入NCBI 進(jìn)行檢索，檢索式：“SSc and 重點(diǎn)靶基因”；然后閱讀檢索出的文獻(xiàn)，分析其是否與SSc 發(fā)病相關(guān)；
　　 如有多個(gè)（≧5個(gè)）由同一個(gè)miRNA 調(diào)節(jié)的靶基因與SSc 發(fā)

8、病相關(guān)，那么就可以初步預(yù)測(cè)出該miRNA與SSc的發(fā)病相關(guān)；
　　 生物信息學(xué)方法查詢出差異表達(dá)microRNA 所調(diào)節(jié)的靶mRNA，PubMed上檢索出目前已發(fā)表文獻(xiàn)中與系統(tǒng)性硬皮病發(fā)病相關(guān)的靶mRNA，即可初步預(yù)測(cè)出該microRNA與系統(tǒng)性硬皮病的發(fā)病相關(guān)。
　　 三、結(jié)果
　　 1．我們首次從系統(tǒng)性硬皮病患者皮損中篩選出24個(gè)差異表達(dá)microRNA，其中9個(gè)microRNA表達(dá)上調(diào)， 15個(gè)microR

9、NA表達(dá)下調(diào)；并隨機(jī)抽取三個(gè)microRNA——has-let-7g, has-miR-206和has-miR-125b，用Real-time PCR的方法進(jìn)行可靠性驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致，表明芯片結(jié)果可靠；
　　 2．通過(guò)生物信息學(xué)（www.gogene.org，目前該網(wǎng)站在維護(hù)中，不能打開(kāi)，可以通過(guò)http://www.targetscan.org 進(jìn)行microRNA靶mRNA的查詢）和文獻(xiàn)分析（http://w

10、ww.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）發(fā)現(xiàn)有6個(gè)差異表達(dá)的microRNA 其調(diào)節(jié)的靶基因與SSc的發(fā)病相關(guān)，其中has-miR-206 調(diào)控的584 條靶基因中有7 條與SSc 發(fā)病密切相關(guān)；has-let-7g 調(diào)控的819 條靶基因中有24 條與SSc 發(fā)病密切相關(guān)；has-miR-133a 調(diào)控的502 條靶基因中有12 條與SSc 發(fā)病密切相關(guān)；has-miR-125b 調(diào)控的604 條靶基因中有8 條與SS

11、c 發(fā)病密切相關(guān)；has-miR-140-5p 調(diào)控的251條靶基因中有7 條與SSc 發(fā)病密切相關(guān)；has-miR-23b 調(diào)控的480條靶基因中有14 條與SSc 發(fā)病密切相關(guān)。
　　 四、結(jié)論
　　 1．microRNA不僅參與了系統(tǒng)性硬皮病的發(fā)病過(guò)程，而且可能在系統(tǒng)性硬皮病的發(fā)病中扮演著重要的角色；
　　 2．Has-miR-206等6個(gè)miRNA與SSc 發(fā)病密切相關(guān)，并很可能在SSc的發(fā)病中起著較為重