1、目的:
　　視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是視網(wǎng)膜光感受細胞和視網(wǎng)膜色素上皮變性引起的致盲性、遺傳性眼病，目前尚無治愈方法。干細胞移植是治療RP的最具前景的治療手段。其中胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)是一類具有無限擴增和多向分化潛能的干細胞，其中人胚胎干細胞來源的網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinalpigment epithelium，RPE)細胞已經(jīng)成功用于干性老年

2、黃斑變性和Stargart病的Ⅰ/Ⅱ期臨床治療，初步證實其在治療視網(wǎng)膜色素變性疾病中的安全性和有效性。
　　視網(wǎng)膜祖細胞(retinal progenitor cells，RPCs)是眼早期發(fā)育階段中具備分化為6種視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞、RPE和1種膠質(zhì)細胞能力的多能性干細胞，它可由ESCs體外誘導(dǎo)分化形成。c-kit是一種干細胞因子受體，已有研究表明，從器官來源的c-kit陽性細胞具有自我更新和多分化潛能。由于c-kit是一種細胞膜抗原

3、，可以通過流式細胞儀分離純化c-kit陽性細胞。同時，已有研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層亦存在c-kit陽性細胞，且其表達高峰集中在視網(wǎng)膜祖細胞的較成熟階段。本研究將c-kit和ESCs標記物SSEA1(stage-specific embryonic antigen1，SSEA1)結(jié)合，推測在ESCs向視網(wǎng)膜終末細胞分化的過程中c-kit+/SSEA1-細胞群代表發(fā)育較成熟的視網(wǎng)膜祖細胞，且細胞成瘤風(fēng)險很低。從ESCs的分化細胞中篩選出c-

4、kit+/SSEA1-細胞，有進一步將其向RPE細胞分化的能力。
　　RPE細胞層位于視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮和脈絡(luò)膜毛細血管層之間，它具有特殊的結(jié)構(gòu)和生理機能。在脊椎動物，RPE來源于視杯的神經(jīng)外胚葉外層，經(jīng)過一系列誘導(dǎo)作用和時間、空間上的協(xié)調(diào)，形成成熟的RPE細胞，是體內(nèi)最早產(chǎn)生黑色素的細胞。在視泡早期，視覺神經(jīng)上皮的發(fā)育主要受多種細胞外轉(zhuǎn)錄因子和眼外間葉細胞分泌因子的影響，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族（transforming grow

5、th factorβfamily，TGF-β）中的骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）和活化素A(activin A)以及成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）等。目前，將ESCs體外誘導(dǎo)分化成RPE細胞的研究已經(jīng)取得了重要進展，誘導(dǎo)方法主要分為兩種:第一，采用PA6間充質(zhì)細胞系作為飼養(yǎng)細胞層，在無bFGF培養(yǎng)基條件下誘導(dǎo)出RPE細胞并進一步擴增;第二

6、，采用ESCs懸浮培養(yǎng)形成擬胚體（embryonic bodies，EBs），再將EBs在層黏連蛋白和纖維連接蛋白或者明膠處理過的培養(yǎng)皿上貼壁培養(yǎng)后得到RPE細胞。第1種方法誘導(dǎo)效率低、誘導(dǎo)時間長，本研究采用同第2種方法相似的誘導(dǎo)方法。
　　本課題的研究日的在于初步探索mESCs來源的c-kit+/SSEA1-視網(wǎng)膜祖細胞體外向RPE細胞分化的方法及效率，為由視網(wǎng)膜色素上皮變性引起的致盲性眼病的細胞移植尋求新的治療細胞。
　

7、　方法:
　　第一部分:小鼠胚胎干細胞來源的c-kit+/SSEA1-細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　1.小鼠胚胎干細胞株AB1進行傳代培養(yǎng)。干細胞標記物SSEA1鑒定傳21代、26代和31代的mESCs。
　　2.用懸浮培養(yǎng)添加誘導(dǎo)因子形成EBs的方法誘導(dǎo)mESCs向視網(wǎng)膜祖細胞分化，免疫熒光染色鑒定分化第9天細胞中c-kit標記物的表達情況。
　　3.用流式細胞分選儀分選出分化第9天細胞中的c-kit+/SSEA1-細

8、胞群，免疫熒光染色鑒定分選后細胞中視網(wǎng)膜祖細胞標記物Nestin、Pax6和c-kit的表達情況。
　　第二部分:小鼠胚胎干細胞來源的c-kit+/SSEA1-細胞向視網(wǎng)膜色素上皮細胞的分化及鑒定
　　1.用貼壁培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞來源的c-kit+/SSEA1-細胞向視網(wǎng)膜色素上皮細胞分化。
　　2.收集分化第0天、第10天和第40天的細胞，流式細胞儀鑒定視網(wǎng)膜色素上皮前體細胞標記物Mitf、 Pax6的表達

9、情況。
　　3.收集分化第0天、第10天和第40天的細胞，免疫熒光染色鑒定分化第40天視網(wǎng)膜色素上皮細胞成熟標記物Bestrophin的表達情況，流式細胞儀鑒定視網(wǎng)膜色素上皮細胞成熟標記物Bestrophin、CRALBP和RPE65的表達情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分:小鼠胚胎干細胞來源的c-kit+/SSEA1-細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　1.傳21代、26代和31代的mESCs均陽性表達干細胞相關(guān)標記物SSEA

10、1。傳代P21的mESCs細胞群中SSEA1比例為（80.3±4.9）％;P26的mESCs細胞群中SSEA1陽性細胞比例為（74.9±1.1）％;P31的mESCs細胞群中SSEA1陽性細胞比例為（72.4±2.3）％。
　　2.在懸浮培養(yǎng)添加誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)條件下mESCs在分化第一天形成懸浮的EBs，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加球體體積逐漸增大，于分化第9天檢測分化的部分細胞c-kit陽性表達。
　　3.分選出的分化第9天細胞中的c

11、-kit+/SSEA1-細胞群貼壁分化，c-kit+/SSEA1-細胞群陽性表達Nestin、Pax6、Ki67和c-kit。
　　第二部分:小鼠胚胎干細胞來源的c-kit+/SSEA1-細胞向視網(wǎng)膜色素上皮細胞的分化及鑒定
　　1.mESCs來源的c-kit+/SSEA1-細胞向RPE分化第25天觀察到“鋪路石”樣細胞形態(tài)，胞體中可見黑色色素顆粒沉積。
　　2.分化前第0天mESCs細胞中Mitf比例為（1.7±1.

12、5）％，Pax6比例為(6.5±0.2)％;分化第10天，培養(yǎng)體系中Mitf陽性細胞比例為（28.5±7.2）％，Pax6陽性細胞比例為（60.2±15.6）％;分化第40天，培養(yǎng)體系中Mitf陽性細胞比例為（5.7±2.1）％，Pax6陽性細胞比例為（4.6±0.6）％。
　　3.分化前第0天mESCs細胞中Bestrophin陽性細胞比例為（1.2±0.2）％，CRALBP陽性細胞比例為（2.3±0.3）％，RPE65陽性細胞

13、比例為（1.3±0.1）％;分化第10天培養(yǎng)體系中Bestrophin陽性細胞比例為（45.5±1.2）％，CRALBP陽性細胞比例為（6.0±0.1）％，RPE65陽性細胞比例為（4.3±2.2）％;分化第40天培養(yǎng)體系中Bestrophin陽性細胞比例為（61.6±2.4）％，CRALBP陽性細胞比例為（31.0±3.9）％，RPE65陽性細胞比例為（57.8±2.0）％。
　　結(jié)論:
　　本課題研究了mESCs向RPC