1、目的：本研究采用組織化學(xué)、免疫組化、RT-PCR、PCR-ELISA等方法觀察了正肝方對黃曲霉毒素B1(AFB1)誘發(fā)的大鼠肝癌前病交的影響，以及正肝方藥物血清對人肝癌細(xì)胞分化和端粒酶的影響，以明確正肝方對肝癌的預(yù)防作用及其主要作用機(jī)制。本研究為將正肝方開發(fā)為肝癌預(yù)防新藥，在臨床上推廣應(yīng)用，提供一定的理論依據(jù)。 材料與方法： 1.動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：Wister雄性大鼠100只，隨機(jī)分為4組：模型對照組(A組)30只、正肝方小

2、劑量預(yù)防組(B組)30只、正肝方大劑量預(yù)防組(C組)30只、正常大鼠對照組(D組)10只。除正常大鼠對照組外，先后用AFB1和2-乙酰氨基芴(2-AAF)處理各組大鼠造模。正肝方大、小劑量預(yù)防組在造模期間，將正肝方水劑(單味免煎中藥粉劑按比例稱取，用無菌蒸餾水溶解，配成0.3g/ml和0.6g/ml的水劑)按10ml/kg分別灌喂大鼠；模型對照組(A組)用無菌蒸餾水按10ml/kg灌喂大鼠．8周后處死大鼠，采血，取肝組織標(biāo)本．將肝組織標(biāo)

3、本分別HE染色和鈾鉛染色，光鏡、電鏡病理觀察；采用組織化學(xué)法結(jié)合電腦圖象分析檢測肝組織γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)陽性灶、免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測肝組織谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-π(GST-P)陽性灶、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、甲胎蛋白(AFP)、胰島素樣生長因子Ⅱ (IGF-Ⅱ)和細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)法檢測肝臟組織IGF-Ⅱ、Cyclin D1

4、和CDK4基因表達(dá)；比色法檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、GGT，總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)生化指標(biāo)。 2.體外血清藥理實(shí)驗(yàn)：正肝方水煎劑(1.5g/ml)，灌喂正常大鼠，每甚2次，連續(xù)3d，于第4d，1次給予全日劑量后1h采血，制備藥物血清，藥物血清經(jīng)56℃滅活30min。以正常鼠血清為陰性對照，維甲酸為陽性對照，將藥物血清溫育Bel-7402人肝癌細(xì)胞。噻

5、唑藍(lán)(MTT)比色法測定細(xì)胞增殖，圖象分析系統(tǒng)測定細(xì)胞核質(zhì)比，放射免疫法測定細(xì)胞分泌的AFP含量，動(dòng)態(tài)比色法測定細(xì)胞內(nèi)oGT和ALP活性，多聚酶鏈反應(yīng)一酶聯(lián)免疫吸附法(PCR-ELISA法)檢測細(xì)胞端粒酶活性。 結(jié)果： 1.動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： 1.1各組大鼠一般情況：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組大鼠體重大小較一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，正常對照組的大鼠體重增長大于造模組(P＜0.01)；模型組(A組

6、)、正肝方小劑量組(B組)和大劑量組(c組)3組間大鼠生長情況相似，體重增長無差異顯著性(P＞0.05).表明正肝方無論是大劑量還是小裁量，對大鼠都是安全的，沒有明顯的毒副作用．實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，A組死亡12只，B組15只，C組13只，D組無死亡． 1.2各組大鼠肝組織形態(tài)及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)交化：光鏡下：A、B、C組大鼠的肝組織切片(HE染色)可見到散在的，大小不等的增生肝細(xì)胞灶或結(jié)節(jié)；肝細(xì)胞增生灶多少不等，A組最多，C組最少；灶/結(jié)節(jié)內(nèi)

7、以嗜堿性肝細(xì)胞為主，個(gè)別灶內(nèi)肝細(xì)胞濁腫變形、點(diǎn)狀壞死；部分灶/結(jié)節(jié)內(nèi)肝細(xì)胞異型，體積變大，見少量雙核、核深染、巨核細(xì)胞。電鏡下：增生灶內(nèi)肝細(xì)胞可見細(xì)胞器排列集中，胞質(zhì)內(nèi)含大量線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。細(xì)胞核大，不規(guī)則，核仁突出，部分細(xì)胞雙核，可見兩個(gè)以上核仁，染色質(zhì)疏松，邊集． 1.3各組大鼠肝組織GGT和GST-P陽性灶的比較：正肝方小劑量組的每個(gè)GGT灶面積(mm2/個(gè))少于模型組(P<0.05)，但單位面積GGT灶個(gè)數(shù)(個(gè)/

8、cm2)、單位面積灶的總面積(mm2/cm2)無明顯減少(P>0.05)．正肝方大劑量組的單位面積GGT灶個(gè)數(shù)、單位面積灶的總面積和每個(gè)灶面積與模型組比均顯著減少(P<0.01)．與小劑量組比，正肝方大劑量組的GGT灶個(gè)數(shù)、灶的總面積和每個(gè)灶面積顯著減少(P<0.01)，提示正肝方減少AFB1誘發(fā)的大鼠肝組織GGT灶面積的作用有一定的量效關(guān)系． 與模型組比，正肝方小劑量組的每個(gè)GST-P灶面積(mm2/個(gè))，單位面積GST-P灶

9、個(gè)數(shù)(個(gè)/cm2)、單位面積灶的總面積(mm2/cm2)無明顯減少(P>0.05)．正肝方大劑量組的單位面積GST-P灶個(gè)數(shù)、單位面積灶的總面積和每個(gè)灶面積與模型組比均顯著減少(P<0.05或P<0.01)，提示大劑量正肝方具有抑制癌前病變肝組織GST-P灶的作用． 1.4各組大鼠肝功能的比較：與模型組比較，正肝方小劑量組和大劑量組的ALT、GGT、TBIL值顯著降低(P<0.01或P<0.05)，大劑量組的AST、ALP值也顯

10、著低于模型組(P<0.01或P<0.05)。與小劑量組比較，大劑量組的ALT值顯著低于小劑量組(P<0.01)，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。以上提示：正肝方能保護(hù)肝功能，減輕AFB1和2-AAF導(dǎo)致的肝損傷作用。 1.5各組大鼠肝組織PCNA、AFP免疫組化染色結(jié)果：正肝方大劑量組PCNA和AFP染色的陽性單位(PU)值較模型組均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，大劑量組PCNA和AFP染色的標(biāo)記指數(shù)(LI)值也低于模型組(P<

11、0.01)。提示大劑量正肝方能有效降低大鼠癌前病變肝組織PCNA和AFP的表達(dá)，減輕大鼠癌前病變肝細(xì)胞的異常增生． 1.6各組大鼠肝組織Cyclin D1、CDK4表達(dá)情況：正肝方小劑量組和大劑量組Cyclin D1染色的LI和PU值較模型組均顯著降低(P<0.01)，大劑量組Cyclin D1染色的PU值也低于小劑量組(P<0.05)，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系；正肝方小劑量組和大劑量組CDK4染色的PU值均較模型組顯著降低，大劑量

12、組PU值也低于小劑量組．正肝方小劑量組和大劑量組的Cyclin D1和CDK4 mRNA表達(dá)水平較模型組表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)．提示大劑量正肝方能降低大鼠癌前病交肝組織Cyclin D1、CDK4蛋白和mRNA異常高表達(dá)水平． 1.7各組大鼠肝組織IGF-Ⅱ表達(dá)情況：與模型組比較，正肝方小劑量組和大劑量組的PU值顯著降低(P<0.01或P<0.05)，大劑量組的LI值也低于模型組(P<0.05)．與模型組比較，對照組

13、IGF-ⅡmRNA相對表達(dá)水平最低(P<0.01)，正肝方小劑量組和大劑量組的IGF-Ⅱ mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)．與小劑量組比較，大劑量組的IGF-ⅡmRNA表達(dá)水平亦顯著低于小劑量組(P<0.01)，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系,提示正肝方能降低大鼠癌前病變肝組織IGF-Ⅱ蛋白和mRNA異常高表達(dá)水平。 2.體外血清藥理實(shí)驗(yàn)： 2.1.藥物血清對Bel-7402細(xì)胞增殖的影響(MTT比色法)：對照組、正肝方組

14、、維甲酸組A490值分別為1.704±0.102、1.483±0.077、1.510±0.104.與對照組比，正肝方藥物血清組A值顯著降低(P<0.01)。提示正肝方可抑制Bel-7402細(xì)胞的增殖。 2.2藥物血清對Bel-7402細(xì)胞核質(zhì)比的影響：對照組、正肝方組、維甲酸組Bel-7402細(xì)胞核質(zhì)比分別為1.04±0.09、0.71±0.07、0.69±0.08.與對照組比，正肝方藥物血清組和維甲酸組核質(zhì)比顯著降低(P<0.

15、01)．提示正肝方可降低Bel-7402細(xì)胞核質(zhì)比． 2.3藥物血清對Bel-7402細(xì)胞分泌AFR的影響：對照組、正肝方組、維甲酸組Bel-7402細(xì)胞AFP分泌量(ng/106)分別為22.58±2.68、14.60±1.85、13.50±2.50。與對照組比，正肝方藥物血清組和維甲酸組AFP分泌量顯著低于對照組(P<0.01)，表明正肝方和維甲酸均可抑制Bel-7402細(xì)胞分泌AFP。 2.4藥物血清對Bel-74

16、02細(xì)胞GGT和ALP活性的影響：與對照組比，正肝方藥物血清組和維甲酸組細(xì)胞內(nèi)GGT活性明顯降低(P<0.05)，ALP活性顯著增高(P<0.01)。提示正肝方可降低Bel-7402細(xì)胞內(nèi)GGT活性，升高ALP活性。 2.5藥物血清對Bel-7402細(xì)胞端粒酶活性的影響B(tài)el-7402對照組、正肝方組．A450值分別為0.929±0.066、0.360±0.105.兩者比較，正肝方藥物血清組端粒酶活性顯著低于Bel-7402細(xì)胞對照組(