1、華南師范大學碩士學位論文端粒酶亞單位的siRNA對肝癌的作用姓名：楊德華申請學位級別：碩士專業(yè)：植物學指導教師：林德球;金由辛20050601華南師范大學頸士研究生學位論文 端粒酶亞單位的s 1 3 R N A 對肝癌的作用中 文 摘 要肝癌是一種最常見的惡性腫瘤，一直沒有很好的治療方法，目前傾向于化療、基因治療等多種方法聯(lián)合治療，K i m 等用T R A P 法檢測發(fā)現(xiàn)肝細胞中不表達端粒酶活性，而肝癌細胞中則有很高的表達，這從一定程

2、度上表明端粒酶可以作為靶點用于肝癌的診斷和治療。端粒是真核細胞線性染色體末端的結(jié)構。對染色體末端起保護作用，端粒的長度與端粒酶活性有關，人類端粒酶由具有催化活性的亞單位( h T E R T ) 、端粒酶模板R N A ( h T R ) 和端粒結(jié)合蛋白( h T E P —1 ) 組成，其中h T E R T 和h T R 為端粒酶功能所必需。本文通過R N A 干擾技術特異下調(diào)端粒酶亞單位h T R 和h T E R T 基因的表達

3、，研究了s i R N A 下調(diào)的效果以及下調(diào)以后對端粒酶活性以及肝癌細胞增殖和凋亡的影響，探討了控制人肝癌細胞端粒酶活性的可能性，并為將端粒酶作為抗肝癌新藥靶點提供了初步的實驗依據(jù)。針對h T E R T 基因設計并化學合成了三對s i R N A 。另設計了兩對s i R N A ，并通過P C R 擴增法獲得其D N A 表達模板，然后將其亞克隆入p E G F P 載體中。同時針對h T R 基因設計了三對s i R N A ，

4、并用同樣的方法將其模板亞克隆入p E G F P 載體中。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將s i R N A 轉(zhuǎn)染入人肝癌細胞株B e l 一7 4 0 4細胞中，直接合成和載體表達的s i R N A 分別以o l i g o f e c t a m i n 和l i p o f e c t a m i n 2 0 0 0 脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染；熒光顯微鏡檢測s i R N A 表達載體轉(zhuǎn)染細胞的效率；G - 4 1 8 選擇培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達載體s i

5、R N A 的細胞株；轉(zhuǎn)染s i R N A 適當天數(shù)質(zhì)以T r i z o l 試劑抽提細胞總R N A ，R T —P C R 檢測基因表達變化，端粒末端重復序列擴增( T R A P ) 法檢測端粒酶活性變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡；R e a l - t i m e P C R 檢測P E G I O 基因表達與h T E R T 基因表達的影響。針對h T E R T 和h T R 基因設計的一共八對s i R N A 均能不