1、研究背景
　　 目前,已經(jīng)有許多研究證實血管炎癥與血管動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),在心血管疾病病理過程中起了非常重要的作用。其中,作為血管的重要組成部分,內(nèi)皮細(xì)胞在血管的免疫和炎癥反應(yīng)中起著重要作用,內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的炎癥激活是許多疾病發(fā)展的關(guān)鍵,比如其是組織缺血一再灌注損傷中單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集和浸潤的關(guān)鍵步驟,也是動脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵部分。
　　 Toll-like receptors(TLRs)是一種病原體功能

2、識別受體,可以識別細(xì)菌,病毒以及其它一些病原體。TLR2或者TLR4被生物配體刺激后,可以激活細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)通路活化,誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生。因此,TLR2和TLR4在細(xì)胞內(nèi)的免疫和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。在體內(nèi),組織缺血一再灌注損傷時可以導(dǎo)致許多TLR受體激活物的釋放,比如熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)和高遷移率蛋白(high mobilit),group box1,HMGB1)。孟憲忠教授等的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)心肌組

3、織的TLR2/4在缺血組織中的白細(xì)胞浸潤起著非常關(guān)鍵的作用,與心肌的缺血一再灌注損傷的機(jī)制有關(guān)。目前對于TLRs在血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥中的作用,以及內(nèi)皮細(xì)胞炎癥在缺血心肌中作用尚缺乏研究。
　　 人類心血管疾病發(fā)病的性別差異已得到普遍認(rèn)同。女性可以從雌激素的心血管保護(hù)作用中受益,但保護(hù)作用在婦女絕經(jīng)后就終止了。這種心血管疾病的性別差異在動物中也被發(fā)現(xiàn)。幾項研究證實雌性小鼠心肌梗死后比雄性小鼠有更好的心功能,同時早期的炎癥反應(yīng)減輕,纖

4、維性修復(fù)加強(qiáng),左室不良重構(gòu)范圍減小。而且,雌性小鼠對缺血中TNFR1通路的抵抗更強(qiáng)。雌激素明顯具有抗炎癥反應(yīng)的作用,在雌性小鼠中具有心血管保護(hù)作用。TLR2明顯在缺血后心肌的損傷和心功能減退中起著重要作用。但是,之前這些研究都是集中在雄性小鼠的TLR2作用上面,對TLR2在雌性小鼠中的作用缺乏研究。
　　 雌激素是調(diào)節(jié)組織和細(xì)胞損傷后炎癥反應(yīng)的重要因子。幾項研究提示雌激素與TLRs之間有相互作用。LPS誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥反應(yīng)在雌

5、性小鼠中減輕,但在注射睪酮后增強(qiáng)。另外,17β-雌二醇可以通過雌激素受體,抑制TLR誘導(dǎo)的IL-8在囊性纖維化支氣管內(nèi)上皮細(xì)胞的釋放。但是,在巨噬細(xì)胞中,去除內(nèi)源性的雌激素后既可以減少促炎因子,也可以減少抗炎因子的產(chǎn)生,同時伴隨細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的減少。同樣地,睪酮也可以減少巨噬細(xì)胞TLR4的表達(dá)。這些研究提示性激素可以改變TLRs的表達(dá)和TLRs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),但對于缺血后TLR2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是否有性別差異并不清楚。
　　

6、 而在1型糖尿病人群中,動脈粥樣硬化在年輕時已經(jīng)發(fā)生,而且進(jìn)展迅速,但是其中的機(jī)制尚不清楚。很多研究揭示TLR2和TLR4兩種受體在動脈粥樣硬化的發(fā)展機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。另外,TLR2配體肽聚糖(peptidoglycan,PGN)和TLR4配體脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于血管早期粥樣硬化斑塊中。當(dāng)這些細(xì)菌抗原誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生大量促炎因子時,它們對冠脈內(nèi)皮細(xì)胞(coronary artery e

7、ndothelial cells,CAECs)的炎癥反應(yīng)的作用尚未可知。因此,對于TLR2/4刺激時1型糖尿病對CAEC炎癥反應(yīng)的影響進(jìn)行研究,將有助于了解這種疾病對于動脈粥樣硬化影響的機(jī)制。
　　 目前已經(jīng)有研究揭示TLR2和TLR4參與了1型糖尿病的病理生理機(jī)制中。在1型糖尿病模型中,TLR2參與了胰島的自體免疫反應(yīng)。在自發(fā)1型糖尿病的NOD小鼠中,骨髓來源的巨噬細(xì)胞中TLR2,以及TLR3-5的表達(dá)都升高了。胰島素也被發(fā)現(xiàn)

8、可以抑制單核細(xì)胞中TLR2轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。另外,糖尿病病人中B細(xì)胞炎癥反應(yīng)中TLR4的功能也發(fā)生了改變,可能是由促炎因子IL-8的升高和抗炎因子IL—10的缺乏兩種原因引起的。這些研究結(jié)果揭示了1型糖尿病中細(xì)胞TLR表達(dá)和反應(yīng)發(fā)生變化與疾病有關(guān),但是在1型糖尿病CAECs中TLR2/4的表達(dá)水平和炎癥反應(yīng)的改變尚有待研究。
　　 本實驗中,我們假設(shè)TLR2和TLR4激活可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá),TLR2受體在雌雄小鼠中的

9、作用不完全相同,1型糖尿病可以增強(qiáng)TLRs介導(dǎo)的冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)。我們利用TLR2受體激活劑PGN和TLR4受體激活劑LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的TLRs受體,探討TLRs介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng),以及1型糖尿?qū)ζ涞挠绊懞涂赡艿臋C(jī)制。利用小鼠心肌梗死模型,探討TLR2在心肌梗死后的炎癥反應(yīng)是否存在性別差異。
　　 第一章 TLR2和TLR4激活誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)
　　 目的：
　　 研究TLR2

10、和TLR4激活誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)情況和可能的機(jī)制。
　　 方法：
　　 分離小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞,分別予TLR2激活物PGN和TLR4激活物L(fēng)PS進(jìn)行干預(yù)。利用實時定量PCR方法分析ICAM-1 mRNA的表達(dá),ELISA方法分析IL-6和IL-8的表達(dá),免疫印跡分析ICAM-1蛋白表達(dá)和NF-κB活化的變化。
　　 結(jié)果：
　　 PGN和LPS誘導(dǎo)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1蛋白的表達(dá)在T

11、LR2敲除和TLR4突變時表達(dá)明顯減弱。TLR2和TLR4激活可以誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM—1mRNA水平增加,ICAM—1蛋白,IL-6和IL-8表達(dá)增加,NF—κB活化增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　 PGN和LPS分別通過TLR2和TLR4誘導(dǎo)小鼠心臟微血管內(nèi)皮中炎癥反應(yīng)。TLR2和TLR4激活可以誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能是TLR的激活增強(qiáng)了通路中NF-κB的活化。
　　 第二章 TLR2在心

12、肌缺血后炎癥反應(yīng)和心力衰竭的作用具有性別差異
　　 目的：
　　 研究TLR2在雄性和雌性小鼠心肌梗死后的炎癥反應(yīng)和左室早期不良重構(gòu)中的作用。
　　 方法：
　　 在雌性和雄性野生型(Wild type,WT)和TLR2基因敲除(Knock out,KO)小鼠中結(jié)扎左前降支冠脈,制造心肌梗死模型。部分小鼠3天后處死,ELISA和免疫印跡分別分析心臟組織內(nèi)MCP-1和ICAM-1表達(dá)水平,組織切片利用免疫熒

13、光方法檢測中性粒細(xì)胞的浸潤,部分小鼠7天后測量心臟功能,取心肌組織HE染色分析心肌梗死面積,免疫熒光分析單核細(xì)胞的聚集。
　　 結(jié)果：
　　 與雄性野生型小鼠相比,雄性TLR2 KO小鼠缺血心肌組織中MCP-1和ICAM-1水平降低,白細(xì)胞聚集減少,伴隨心肌梗死面積的減小和左室功能的改善。TLR2在雌性野生型小鼠心肌組織的表達(dá)沒有改變,細(xì)胞對TLR2激活物PGN的炎癥反應(yīng)也相同,心肌梗死后的炎癥反應(yīng)和損傷有所減輕,但TL

14、R2 KO并沒有顯示出進(jìn)一步的保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：
　　 雄性小鼠TLR2基因敲除后可以抑制缺血后心肌炎癥反應(yīng),減少心肌梗死面積和改善早期左室重構(gòu)。但是,雌性小鼠并不能從TLR2基因敲除中受益。TLR2在心肌缺血后的炎癥反應(yīng)和損傷中具有性別差異,提示對TLR2通路的干預(yù)作用可能只對雄性有治療意義。
　　 第三章 TLR2/4誘導(dǎo)人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制
　　 目的：
　　 TLR2/4

15、介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在粥樣硬化中起著重要作用,探討1型糖尿病是否可以增強(qiáng)TLR2/4介導(dǎo)的冠脈內(nèi)皮細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)。
　　 方法：
　　 非糖尿病和糖尿病CAECs分別予TLR2激活物PGN和TLR4激活物L(fēng)PS進(jìn)行干預(yù)。利用實時定量PCR方法分析ICAM-1,IL-6和IL-8mRNA的表達(dá),免疫印跡分析ICAM-1蛋白表達(dá),ELISA分析IL-6和IL-8小分子肽的表達(dá),免疫印跡和免疫熒光的方法分析NF-κB的活化。另外,

16、在TLR激活之前一個小時,予糖尿病細(xì)胞胰島素處理,觀察胰島素缺乏是否為TLR2/4介導(dǎo)的1型糖尿病CAECs炎癥反應(yīng)變化的原因。
　　 結(jié)果：
　　 TLR2和TLR4刺激可以誘導(dǎo)NF-κB活化,ICAM—1,IL一6和IL-8的表達(dá)。有意思的是,糖尿病細(xì)胞內(nèi)炎癥產(chǎn)物的表達(dá)明顯增加,伴隨NF-κB活化的增強(qiáng),但TLR2和TLR4蛋白水平?jīng)]有明顯改變。利用胰島素進(jìn)一步的干預(yù)并沒有抑制這種增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。
　　 結(jié)論

17、：
　　 糖尿病CAECs對TLR2和TLR4刺激時的炎癥反應(yīng)比非糖尿病細(xì)胞增強(qiáng),單獨使用胰島素并不能抑制其高炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的機(jī)制可能與促炎因子通路的增強(qiáng)有關(guān),而不在于TLR2和TLR4水平的上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)提示糖尿病CAECs屬于高炎癥反應(yīng)細(xì)胞,這種細(xì)胞表型的改變或許是冠狀動脈粥樣硬化易患性的原因。
　　 全文小結(jié)：
　　 1.PGN和LPS是分別通過激活TLR2和TLR4受體誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥

18、反應(yīng)的發(fā)生；
　　 2.TLR2/4的激活引起了NF—κB的磷酸化,是其炎癥反應(yīng)的重要調(diào)控因子；
　　 3.心肌缺血后,TLR2 KO可以抑制雄性小鼠心肌炎癥反應(yīng),減小心肌梗死面積和改善左室重構(gòu)；
　　 4.雌性小鼠心肌梗死時心肌炎癥反應(yīng)和心肌損傷減輕,但不能從TLR2KO中受益；
　　 5.雌性小鼠TLR2 KO作用的消失與心肌TLR2的缺失無關(guān)；
　　 6.在1型糖尿病CAECs中,TLR2和