1、目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone malTOW mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中除造血干細(xì)胞外另一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。在不同的條件下可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等。另外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便，對(duì)機(jī)體損傷小，體外培養(yǎng)增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，選用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行組織再生或移植，不僅沒(méi)有移植排異反應(yīng)，還避免了倫理紛爭(zhēng)。

2、因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是最有前途的組織工程種子細(xì)胞。 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)系統(tǒng)組成細(xì)胞分化是目前研究的熱點(diǎn)，而BMSCs的準(zhǔn)確誘導(dǎo)定向分化是其用于臨床治療的基礎(chǔ)，這就需要對(duì)BMSCs有關(guān)的信號(hào)調(diào)節(jié)、微環(huán)境作用進(jìn)行深入研究。目前研究發(fā)現(xiàn)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化大致上可分為四種途徑：細(xì)胞生長(zhǎng)因子為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)、提高胞內(nèi)cAMP為基礎(chǔ)的方式誘導(dǎo)、抗氧化劑為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)。． Rael是

3、小G蛋白R(shí)ho家族的成員之一，在細(xì)胞中以有活性的GTP形式與無(wú)活性的GDP形式存在，參與細(xì)胞骨架重組、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程，影響細(xì)胞的極性與形態(tài)、粘附與遷移、增殖與分化等細(xì)胞事件。研究證實(shí)，在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中Racl、Cde42、RhoA參與了軸突與樹突的形成。 本實(shí)驗(yàn)以BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過(guò)程中Racl蛋白及其活性形式表達(dá)變化為研究?jī)?nèi)容，旨在探討Rael與BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過(guò)程的關(guān)系。

4、方法：采用Pereoll法分離大鼠骨髓間充質(zhì)手細(xì)胞、通過(guò)傳代得到純化的BMSCs，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表型檢測(cè)及成骨、成脂肪分化能力鑒定。 取第5代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別應(yīng)用丁羥基茴香醚(BHA)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)聯(lián)合誘導(dǎo)劑和全反式維甲酸(RA)、β-巰基乙醇(β-ME)聯(lián)合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞。對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察和免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物。綜合比較兩種誘導(dǎo)方法的效果，從中選擇最適合的一種作為研究Racl與BMSCs

5、向神經(jīng)樣細(xì)胞過(guò)程關(guān)系的實(shí)驗(yàn)方法。 根據(jù)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過(guò)程的特點(diǎn)，設(shè)立A-J十個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)點(diǎn)：細(xì)胞接種后24 h達(dá)到50％匯合為A點(diǎn)，接種后換成含bFGF的預(yù)誘導(dǎo)液培養(yǎng)24 h為B點(diǎn)，預(yù)誘導(dǎo)后換成含BHA的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)5 h為C點(diǎn)，誘導(dǎo)后用含N2的神經(jīng)細(xì)胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h為D點(diǎn)、維持培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)48 h為E點(diǎn)，預(yù)誘導(dǎo)24 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基返回培養(yǎng)24 h為F點(diǎn)，誘導(dǎo)5 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基返回培養(yǎng)18

6、 h為G點(diǎn)、返回培養(yǎng)后再次預(yù)誘導(dǎo)24 h為H點(diǎn)、再次誘導(dǎo)5 h為I點(diǎn)，用神經(jīng)細(xì)胞維持培養(yǎng)基維持培養(yǎng)18 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h為J點(diǎn)。 采用免疫熒光染色檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞表型在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的表達(dá)情況，免疫印跡(Western blot)結(jié)合免疫沉降(Pull-down)的方法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)檢測(cè)點(diǎn)Rael、Cdc42、RhoA蛋白及其活性形式的表達(dá)變化情況。 結(jié)果：免疫熒光染色檢測(cè)顯示體外培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面抗

7、原CD29、CD90、CD106、CD71，而不表達(dá)造血細(xì)胞特異性抗原CD34、CD45，證明了所培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCs。組織化學(xué)染色顯示BMSCs成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化的細(xì)胞分別呈現(xiàn)堿性磷酸酶染色陽(yáng)性和油紅O染色陽(yáng)性，進(jìn)一步鑒定了用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞是具有多向分化潛能的BMSCs。 對(duì)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示，BHA、bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)劑和RA、β-ME聯(lián)合誘導(dǎo)劑均能誘導(dǎo)BMSCs分化為表

8、達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物nestin、β-tubulin和成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NSE的神經(jīng)樣細(xì)胞，而兩種方法分化的細(xì)胞均不表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，BHA、bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)組和RA、β-ME聯(lián)合誘導(dǎo)組誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)成熟神經(jīng)元NSE的陽(yáng)性率分別為80.05％@1 71.61％，兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 采用BHA、bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過(guò)程中，誘導(dǎo)5 h后細(xì)胞的Racl蛋白表達(dá)水平與誘導(dǎo)前相比顯著降低，誘導(dǎo)后用神

9、經(jīng)細(xì)胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h、維持培養(yǎng)48 h與誘導(dǎo)前相比也顯著下降。誘導(dǎo)5 h的細(xì)胞用BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細(xì)胞返回BMSCs的形態(tài)，且Racl蛋白表達(dá)水平比誘導(dǎo)后的細(xì)胞顯著上升，對(duì)該返回BMSCs形態(tài)的細(xì)胞再次誘導(dǎo)，Racl蛋白表達(dá)水平仍然表現(xiàn)出誘導(dǎo)后比誘導(dǎo)前顯著下降的情況。然而，我們對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞用神經(jīng)細(xì)胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后再換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞不能返回BMSCs的形態(tài)，且Racl蛋白表達(dá)仍然維持在一個(gè)較

10、低的水平。BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過(guò)程中，Cdc42、RhoA的蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與Racl一致。蛋白活性檢測(cè)顯示Racl-GrIP活性蛋白表達(dá)在BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過(guò)程中上升，Cdc42-GTP活性蛋白與Racl-GTP變化一致，而RhoA-GTP則下降。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Racl、Cdc42、RhoA．蛋白表達(dá)水平在BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過(guò)程中顯著降低；Racl、Cdc42活性蛋白含量上升，而RhoA活性蛋白含量下降。