1、人腦膠質(zhì)瘤來(lái)源于神經(jīng)上皮組織，是顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤中最常見(jiàn)的類型，近年來(lái)呈患病率增高及患者年輕化的趨勢(shì)。目前腦膠質(zhì)瘤的治療仍然是一個(gè)難題，對(duì)人類生命健康造成嚴(yán)重威脅，因此，尋找更好的抗膠質(zhì)瘤藥物具有十分重要的意義。
　　糖尿病最易并發(fā)腦血管病變，持續(xù)的高血糖引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，使患者神經(jīng)功能受損，預(yù)后不良。因此，除了降血糖外，迫切需要有效措施抑制高血糖毒性，改善神經(jīng)病損，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，進(jìn)而提高臨床治療效果。
　　腦卒中是人類

2、災(zāi)難性疾病，是世界范圍內(nèi)死亡和長(zhǎng)期致殘的三大原因之一，同時(shí)也是世界上單病種導(dǎo)致成人后天功能障礙的首位原因。因此，探索高效的抗氧化神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)腦缺血再灌注損傷的改善及治療具有重要的研究意義和臨床價(jià)值。
　　硒是人體必需的微量元素，對(duì)人體生命活動(dòng)必不可少，可發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、拮抗重金屬等多種作用。已證實(shí)，硒對(duì)維持正常神經(jīng)功能發(fā)揮有重要作用;而硒缺乏可影響神經(jīng)認(rèn)知功能及導(dǎo)致神經(jīng)退行性變，如阿爾茨海默病、帕金森病。大量臨床及

3、動(dòng)物研究證據(jù)顯示，高劑量的硒能加劇氧化應(yīng)激，通過(guò)誘導(dǎo)活性氧族物質(zhì)(ROS)的累積誘導(dǎo)氧化損傷，發(fā)揮促凋亡的功效;而低劑量的硒則具有拮抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡的作用。故人們常常采用高劑量硒作為腫瘤化療制劑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，甚至凋亡，以達(dá)到抑癌、抗癌目的;而采用低劑量硒作為細(xì)胞保護(hù)劑，對(duì)抗機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷。硒代胱氨酸(SeC)是自然可獲取的小分子有機(jī)硒化合物，被稱為人類第21個(gè)必需氨基酸，因其多重藥理學(xué)功效得到廣泛應(yīng)用，尤其是其對(duì)

4、氧化還原通路的調(diào)節(jié)引起眾多研究者的高度關(guān)注。3,3'-二硒二丙酸(DSePA)是SeC的衍生物，性質(zhì)穩(wěn)定、安全性高，具有高效的抗氧化活性，廣泛用于抗氧化研究，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)急性神經(jīng)毒性和慢性神經(jīng)退行性病變均表現(xiàn)出保護(hù)效果。
　　據(jù)報(bào)道，硒缺乏可大大增加機(jī)體患癌風(fēng)險(xiǎn)，而補(bǔ)充硒可降低某些癌癥的發(fā)病率。SeC具有廣譜的抗腫瘤活性，可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡在體內(nèi)、外抑制多種人類腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如肝癌、肺腺癌、乳腺癌及黑色素細(xì)胞瘤，具有潛在的臨床

5、應(yīng)用價(jià)值。近幾年研究還發(fā)現(xiàn):硒化合物聯(lián)合抗腫瘤藥物一起使用，可增強(qiáng)抗腫瘤藥物的敏感性，即硒化合物可作為腫瘤化療的增敏劑。然而，SeC是否對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，其機(jī)制如何，目前尚未見(jiàn)有報(bào)道。
　　大腦屬于高耗氧器官，神經(jīng)元對(duì)葡萄糖的高消耗必然伴隨自由基的大量產(chǎn)生;而高血糖會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系，削弱其清除能力，使大量自由基無(wú)法被及時(shí)清除。持續(xù)高血糖可影響和破壞線粒體內(nèi)膜，啟動(dòng)線粒體膜電位耗散，導(dǎo)致大量自由基外泄。過(guò)多自

6、由基的沉積，會(huì)氧化質(zhì)膜，破壞神經(jīng)突觸，擾亂神經(jīng)元之間的連接，甚至導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，拮抗高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷可明顯減弱神經(jīng)損傷/毒性，改善神經(jīng)病變。然而，有機(jī)硒是否對(duì)高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性有拮抗作用，其機(jī)制如何，目前尚未見(jiàn)有報(bào)道。
　　急性缺血性腦卒中發(fā)作中，腦缺血再灌注損傷的病理機(jī)制復(fù)雜，氧化還原平衡的破壞是其重要的病理特征。氧化應(yīng)激通過(guò)ROS超載導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA損傷，在缺血再灌注腦損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，探索高效

7、的抗氧化神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)腦缺血再灌注損傷的改善及治療具有重要的研究意義和臨床價(jià)值。而硒對(duì)腦缺血再灌注的直接保護(hù)作用，尚未見(jiàn)有研究報(bào)道。
　　故本課題開(kāi)展了在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，SeC及其衍生物DSePA的作用研究，探討有機(jī)硒對(duì)腦膠質(zhì)瘤、高糖神經(jīng)毒性、缺血性腦卒中的作用效果及機(jī)理。首先，本研究選取了人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87為研究對(duì)象，研究SeC對(duì)U87和U251細(xì)胞周期的影響，同時(shí)從影響腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要信號(hào)蛋白MAPKs和A

8、KT入手，分析其可能的作用機(jī)制，為人腦膠質(zhì)瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。其次，本研究選取PC12細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞模型，選用DSePA對(duì)高糖誘導(dǎo)的毒性損傷進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)高糖神經(jīng)毒性的拮抗作用。最后，本研究構(gòu)建了短暫性局灶性腦缺血再灌注(transient focal cerebral ischemia/reperfusion injury，tFCI/R)損傷小鼠模型，以SeC進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　目的：

9、
　　1.探究SeC對(duì)U251、U87兩種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制效果，并探討其潛在的分子機(jī)制。
　　2.探究DSePA在PC12細(xì)胞中對(duì)高糖誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的拮抗效果及機(jī)制。
　　3.探究SeC對(duì)tFCI/R損傷小鼠的保護(hù)功效及機(jī)制。
　　方法：
　　1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251和U87細(xì)胞體外培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、各劑量SeC用藥組。分別以5、10、20μM的SeC處理24 h或48 h。使用

10、相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞生存率，了解SeC對(duì)U251和U87細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析SeC對(duì)U251和U87細(xì)胞周期分布的影響;TUNEL-DAPI法觀察SeC對(duì)U251細(xì)胞DNA的損傷情況;采用DCFH-DA探針和超氧陰離子試劑盒檢測(cè)ROS和超氧陰離子的產(chǎn)生;Western blotting檢測(cè)SeC對(duì)U251中細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin A，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p21、

11、p53及細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的蛋白水平（MAPKs及AKT）的影響。同時(shí)，應(yīng)用SeC聯(lián)合多種通路蛋白抑制劑研究其對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。
　　2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞體外培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、DSePA用藥組，100 mM葡萄糖處理48 h制作高糖損傷細(xì)胞模型，加入DSePA進(jìn)行干預(yù)。采用流式細(xì)胞分析技術(shù)及TUNEL-DAPI共染色觀察細(xì)胞凋亡情況;檢測(cè)caspase-3/-8/-9活性，結(jié)合Western blo

12、tting結(jié)果確定凋亡路徑;通過(guò)JC-1探針評(píng)價(jià)線粒體膜電位，Mito-tracter與DAPI共染色檢測(cè)線粒體結(jié)構(gòu)改變，MitoSOX染料檢測(cè)超氧陰離子;采用DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并加入ROS清除劑進(jìn)一步證實(shí)氧化損傷的作用;使用Western blotting法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　3.手術(shù)制作tFCI/R小鼠模型，通過(guò)多普勒血流監(jiān)測(cè)和神經(jīng)功能缺損評(píng)分篩選手術(shù)合格的小鼠，隨機(jī)分至SeC治療組(SeC)和溶媒對(duì)照組

13、(Vehicle)，同時(shí)設(shè)假手術(shù)對(duì)照組（Sham，小鼠經(jīng)歷手術(shù)全程而不進(jìn)行大腦中動(dòng)脈阻塞）。SeC組小鼠給予術(shù)后連續(xù)3日，每日1次腹腔注射SeC溶液(2 mg/30 g)，Vehicle組和Sham組小鼠給予同樣方式注射等量生理鹽水。于術(shù)后24、48、72 h各進(jìn)行一次神經(jīng)功能缺損評(píng)分及神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試;手術(shù)3天后行TTC染色測(cè)腦梗死體積，干-濕重法測(cè)腦水腫程度變化，免疫熒光染色觀察AQP4表達(dá)情況，TUNEL-DAPI染色觀察神經(jīng)元凋亡

14、情況，Western blotting檢測(cè)活性caspase-3和活性caspase-9表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.MTT結(jié)果顯示，SeC時(shí)間/劑量依賴性地抑制了U251和U87細(xì)胞的生長(zhǎng)，鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞變圓，突觸減少，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，與正常細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明SeC處理誘導(dǎo)了明顯的U251和U87細(xì)胞S期細(xì)胞周期阻滯，這與cyclinA蛋白表達(dá)下調(diào)相一致;TUNEL-DAPI

15、分析和ROS檢測(cè)結(jié)果顯示，SeC處理導(dǎo)致了ROS升高誘導(dǎo)的U251細(xì)胞DNA損傷;Western blotting結(jié)果表明，SeC處理顯著上調(diào)了DNA損傷標(biāo)志物p21和p53的表達(dá)，并引起pJNK、p38、pERK的表達(dá)上調(diào)和pAKT的表達(dá)下降。
　　2.DSePA的預(yù)處理可有效減弱高糖對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)到，DSePA預(yù)處理可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為sub-G1峰的降低;熒光染色技術(shù)結(jié)果表

16、明，DSePA預(yù)處理可有效抑制高糖誘導(dǎo)的染色質(zhì)的斷裂和核濃縮。caspases活性檢測(cè)顯示DSePA抑制了高糖誘導(dǎo)的caspases活性，Western blotting術(shù)從蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的PARP切割和caspase-3/-7/-9激活被DSePA預(yù)處理顯著抑制;線粒體膜電位及結(jié)構(gòu)檢測(cè)證實(shí)，DSePA阻斷了高糖誘導(dǎo)的線粒體損傷。DSePA抑制了PC12細(xì)胞中高糖誘導(dǎo)的超氧陰離子產(chǎn)生和ROS累積。
　　3.tFCI/R

17、術(shù)后24、48、72 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分與神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試表明，隨時(shí)間延長(zhǎng)，所有小鼠神經(jīng)功能損傷及感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙均得到一定程度的改善，而SeC治療組改善顯著，與Vehicle組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;SeC治療組在手術(shù)3天后腦梗死體積和水腫程度上較Vehicle組均有明顯降低，AQP4的表達(dá)比Vehicle組顯著降低，表明SeC明顯緩解了腦組織的梗死和水腫;TUNEL-DAPI染色、Western blotting結(jié)果表明，SeC處理顯著下調(diào)

18、了caspase-3和PARP的裂解，從而抑制了神經(jīng)元凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.SeC劑量/時(shí)間依賴地抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，其分子機(jī)制為通過(guò)調(diào)節(jié)MAPKs和AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞S期阻滯。
　　2.DSePA可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，拮抗高糖神經(jīng)毒性，有望成為拮抗高糖誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的高效策略。
　　3.腹腔注射SeC對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷確有保護(hù)功效，主要是通過(guò)抑制水腫，抵抗氧化作用誘導(dǎo)