1、目的：檢驗(yàn)OAZI-1能否有效結(jié)合腫瘤抗原，如果能夠結(jié)合，OAZI-1/腫瘤抗原復(fù)合物能否通過(guò)促進(jìn)腫瘤抗原提呈而在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)抗腫瘤免疫效應(yīng)。
　　方法：
　　(1)分別克隆獲得小鼠OAZI-1基因和Melan-A基因的編碼序列,構(gòu)建pcDNA3.1(-)/OAZI-1、pcDNA3.1(-)/Melan-A、以及pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1基因融合質(zhì)粒。
　　(2)用pcDNA3.1(-)

2、-OAZI-1真核表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H16-F1黑素瘤細(xì)胞，收集培養(yǎng)細(xì)胞并制備細(xì)胞裂解液，用OAZI-1多克隆抗體和Melan-A的單克隆抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。
　　(3)以上述構(gòu)建的真核質(zhì)粒作為基因疫苗免疫BALB/c小鼠，隨后每10天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共三次，最后一次免疫10天后分別制備小鼠脾細(xì)胞及收集小鼠血液。
　　(4)用淋巴細(xì)胞分離液從脾細(xì)胞中分離淋巴細(xì)胞，并用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)淋巴細(xì)胞亞群。
　?。?）將上

3、述制備的脾細(xì)胞與B16-F1細(xì)胞共培養(yǎng)后，用LDH釋放分析法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。
　?。?）采用ELISA分析法檢測(cè)血清中細(xì)胞免疫相關(guān)因子INF-γ和IL-4的水平。
　　結(jié)果：
　　(1)成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/OAZI-1、pcDNA3.1(-)/Melan-A、以及pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1。
　　(2)免疫共沉淀分析證實(shí)，OAZI-1具有與腫瘤抗原m

4、elan-A結(jié)合的能力。
　?。?）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)比較了免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上述三種基因疫苗接種小鼠后，CD4+T細(xì)胞比率顯著性升高，其中以pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1免疫組和pcDNA3.1(-)/Melan-A免疫組升高更為明顯（二者之間無(wú)顯著性差異）；與之類似，上述三種基因疫苗接種小鼠后，CD8+T細(xì)胞比率也顯著性升高，但以pcDNA3.

5、1(-)/Melan-A-OAZI-1免疫組升高最為顯著，與所有其它組相比均有顯著性差異。
　　(4) LDH釋放分析發(fā)現(xiàn)，用pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1和pcDNA3.1(-)/Melan-A免疫小鼠能顯著增加脾淋巴細(xì)胞的腫瘤殺傷活性，其中以前者更為明顯。
　　(5) ELISA結(jié)果顯示，上述三種基因疫苗免疫小鼠后，僅pcDNA3.1(-)/Melan-A-OAZI-1組小鼠血清中抗腫瘤細(xì)胞因子IL