1、乙型肝炎病毒的致病性來源于包封有病毒DNA的直徑約42nm的球形病毒顆粒。
　　 乙肝病毒基因組有四個開放閱讀框，由于翻譯起點(diǎn)不同，前S 區(qū)/S 區(qū)基因編碼病毒表面三種抗原分子，分別是前S1蛋白(preS1)，前S2蛋白(preS2)和S蛋白。乙肝表面抗原由三種被膜糖蛋白組成，分別是乙肝病毒大蛋白(LHBs)，中蛋白(MHBs)和主蛋白(SHBs)。
　　 從最上游啟動密碼子開始翻譯產(chǎn)生的乙肝病毒大蛋白(LHBs)被認(rèn)為

2、在病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合以及病毒顆粒的聚集和從細(xì)胞中釋放等過程中發(fā)揮重要作用。與其它表面膜蛋白不同的是，LHBs在其N 末端擁有preS1區(qū)域。因此，研究該區(qū)域的生物學(xué)特性和免疫原性非常重要。preS1分子位于LHBs的表面，受宿主免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，具有很強(qiáng)的免疫原性，所以preS1區(qū)域也反映了HBV的基本生物學(xué)特性。研究發(fā)現(xiàn)，在乙肝表面抗原陰性患者的血清及肝臟中出現(xiàn)preS1蛋白已經(jīng)被認(rèn)為是HBV 感染的標(biāo)志物，代表著病毒的復(fù)制。因為L

3、HBs大多位于感染性病毒顆粒的表面，所以對LHBs的檢測顯得尤為重要，而檢測的關(guān)鍵問題在于如何獲得針對preS1區(qū)域的特異性抗體，那么預(yù)測preS 區(qū)域的B細(xì)胞免疫表位很有必要。在我們的研究中，我們利用生物信息學(xué)軟件在線預(yù)測出了preS 區(qū)域的免疫表位并將表位肽段合成且與BSA 交聯(lián)。將交聯(lián)好的表位肽段按照一種新型免疫程序免疫Balb/c小鼠制備單克隆抗體。與此同時，我們制備了可用于preS1結(jié)構(gòu)和功能分析以及篩選單克隆抗體的重組pre

4、S1蛋白。在獲得的單克隆抗體的基礎(chǔ)上，我們建立了檢測血清中HBV LHBs的ELISA分析方法，并對413例臨床血清樣本進(jìn)行了檢測，以驗證所獲抗體的特異性及高效性。上述方法有助于更高效的檢測乙肝病毒感染。
　　 主要研究內(nèi)容和結(jié)果：
　　 1．preS1高效原核表達(dá)基因載體的構(gòu)建及免疫檢測標(biāo)準(zhǔn)品的制備我們從GENBANK 獲得了由357個堿基組成的編碼preS1(1-119aa)蛋白的基因序列(B基因型,adr 血清亞型

5、)。將此序列遞交于GraphicAlcodon usage analyzer(http://guca.schoedl.del)分析發(fā)現(xiàn)該基因序列中有部分編碼氨基酸的密碼子在E.coli BL21中使用的頻率較低，因此可能導(dǎo)致構(gòu)建的重組質(zhì)粒無法在大腸桿菌中順利表達(dá)。根據(jù)大腸桿菌偏嗜的密碼子，通過同義置換的方式對preS1基因序列進(jìn)行偏嗜性改造，改造后的基因序列編碼的氨基酸序列同改造前一致。
　　 接下來我們構(gòu)建了preS1原核表達(dá)

6、載體。將大腸桿菌偏好的編碼preS1氨基酸序列同天然preS1分子(1～119aa)相同的DNA 片段合成并克隆入質(zhì)粒pET32a，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli。經(jīng)1.0mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5h，pET32a-preS1在BL21中表達(dá)出了融合蛋白，分子量約為30.5kD，表達(dá)量占菌體總蛋白的30％以上。經(jīng)鑒定表達(dá)蛋白破菌后主要在上清中，為可溶性表達(dá)。采用離子交換、His 親和層析柱、EK 酶切及過分子篩等技

7、術(shù)建立了preS1重組蛋白的純化方法，獲得了高純度的preS1蛋白。經(jīng)HPLC 檢測所獲純化蛋白純度可達(dá)98％，證明其可用于篩選抗preS1單克隆抗體及分析preS1分子的結(jié)構(gòu)和功能。
　　 2．抗preS1單克隆抗體的制備與鑒定利用B細(xì)胞表位在線預(yù)測軟件，綜合分析蛋白結(jié)構(gòu)β-轉(zhuǎn)角，蛋白抗原表面可及性，蛋白柔韌性，蛋白抗原性，疏水性及線性抗原表位，我們選擇了具有較強(qiáng)抗原特異性的區(qū)段(36-58aa)作為免疫原免疫小鼠。將該肽段合

8、成并與BSA 交聯(lián)后免疫Balb/ c小鼠，免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)在50％聚乙二醇條件下融合，獲得了7株分泌抗preS1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
　　 通過對所獲抗體進(jìn)行亞類分析，我們得到了1-E6(IgG1)和2-G5(IgG2a)兩株抗體，通過ELISA分析、Western blotting、抗體親和力測定以及免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定，證實了其對preS1蛋白的免疫特異性，可以被用來檢測血清中的乙肝大蛋白。

9、>　　 3．抗preS1單克隆抗體在檢測血清LHBs中的應(yīng)用在研究中，我們把特異性的抗preS1單克隆抗體作為捕獲抗體包被在ELISA 微孔板孔中，同時用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗HBsAg 兔多克隆抗體作為二抗即檢測抗體，建立了檢測LHBs的雙抗體夾心ELISA 方法。我們搜集了2009年9月到2010年8月期間第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染科門診或住院的413例乙肝感染者血清標(biāo)本以及100例體檢正常者血清標(biāo)本作為檢測對象。為了比較不同抗體對

10、血清LHBs 檢出陽性率的高低，我們同時用市面上商業(yè)化的抗preS1單克隆抗體作為捕獲抗體進(jìn)行平行檢測。另外我們用同樣的方法對100例體檢正常的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，以證實前述檢測結(jié)果并非假陽性。
　　 研究證實，單克隆抗體1-E6 比商業(yè)化抗體以及2-G5 更能特異結(jié)合preS1,作為捕獲抗體時對LHBs的檢出率也高于商業(yè)化抗體以及2-G5作為捕獲抗體時對LHBs的檢出率。
　　 因此，所獲得的高特異性抗體1-E6 將會為