1、本研究用磷酸鈣共沉淀法將質(zhì)粒pEGFP—N2導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞D3細(xì)胞系中,在熒光顯微鏡下以488nm激發(fā)光檢查陽性克隆,并進(jìn)行初步擴(kuò)增.經(jīng)G418篩選后,機(jī)械挑取EGFP強(qiáng)陽性表達(dá)的克隆,并在絲裂霉素C處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層上進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng),獲得純化的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系.20代以后,轉(zhuǎn)染細(xì)胞仍然表達(dá)綠色熒光蛋白.PCR檢測和序列分析表明8代和18代轉(zhuǎn)染細(xì)胞均攜帶有GFP標(biāo)志基因.對(duì)穩(wěn)定表達(dá)EGFP的干細(xì)胞系進(jìn)行堿性磷酸酶染色、擬胚體

2、和畸胎瘤形成的檢測,證明這些細(xì)胞具有干細(xì)胞的特征.經(jīng)擬胚體,可進(jìn)一步分化成具有搏動(dòng)能力的心肌細(xì)胞,分化百分率為30-40﹪,較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞60-70﹪的分化率低.這些細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下呈綠色熒光,免疫組化染色顯示具心肌細(xì)胞特異的cTnT分子標(biāo)志.該EGFP標(biāo)記的干細(xì)胞系帶有可進(jìn)行原位、實(shí)時(shí)檢測的綠色熒光,可應(yīng)用于細(xì)胞移植和體內(nèi)分化的研究.胚胎干細(xì)胞在添加分化抑制物胚胎成纖維細(xì)胞或LIF等適宜的培養(yǎng)條件下,在體外長期能夠一直增殖保持未

3、分化狀態(tài)和全能性,撤除分化抑制物則進(jìn)入分化狀態(tài),在體外懸浮培養(yǎng)時(shí),胚胎干細(xì)胞形成三維聚集體一擬胚體(embryoidbodies,EBs).EBs是來自一個(gè)或多個(gè)能夠形成或具有潛能形成來自三胚層細(xì)胞的多能干細(xì)胞的分化細(xì)胞聚集體.盡管EBs在ESC分化的過程中扮演著重要角色,但對(duì)于EBs形成方法和形態(tài)上的研究資料仍然很少.本研究除了使用傳統(tǒng)的懸滴法以外,建立了STO法等其他方法獲得EBs,以心肌樣細(xì)胞發(fā)育作為模式系統(tǒng)比較細(xì)胞增殖和分化,以

4、ESC是否形成搏動(dòng)心肌細(xì)胞檢測在不同分化培養(yǎng)體系中比較正常EB的形成.結(jié)果表明以所建立的STO法、懸浮法、膠原酶法與傳統(tǒng)的懸滴法相比,均可以得到不同比例的出現(xiàn)搏動(dòng)心肌的EBs,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示只有STO法得到的EBs數(shù)與懸滴法相比無顯著性差異,p>0.05;而懸浮法和膠原酶得到的EBs數(shù)低于懸滴法,具有顯著性差異(p<0.05).形態(tài)研究表明,所得到的EBs經(jīng)過了簡單擬胚體(sEB)發(fā)育為囊狀擬胚體(cEB)或成熟擬胚體(mEB),EBs細(xì)