1、目的:
　　 探討透骨消痛膠囊含藥血清影響軟骨細胞活性與線粒體凋亡通路及細胞外基質(zhì)的作用機制。
　　 方法:
　　 1.清潔級4周齡SD大鼠50只,抽簽法隨機分為5組,即:空白組、對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組,每組各10只。分別給予相對應(yīng)的給藥量灌胃3d,腹主動脈采血,制備透骨消痛膠囊含藥血清。
　　 2.清潔級4周齡SD大鼠20只,取膝關(guān)節(jié)軟骨建立軟骨細胞體外培養(yǎng)體系,甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫

2、組化染色鑒定軟骨細胞,MTT法繪制軟骨細胞生長曲線,選取理想的種子細胞。第3代軟骨細胞同步化,分別加入含10％空白組、實驗2組的血清DMEM培養(yǎng)24h、48h、72h、96h,MTT法檢測軟骨細胞活性,確定含藥血清的有效干預(yù)時間;第3代軟骨細胞同步化,分別加入含5％、10％、15％、20％的空白組、實驗2組的血清DMEM培養(yǎng)72h,MTT法檢測軟骨細胞活性,確定含藥血清的有效干預(yù)濃度。
　　 3.第3代軟骨細胞培養(yǎng)72h,抽簽法

3、隨機分為凋亡1組、凋亡2組、凋亡3組、凋亡4組,干預(yù)24h,熒光倒置相差顯微鏡觀察軟骨細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),Hocehst33342染色檢測軟骨細胞的凋亡率,確定SNP誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡的量效關(guān)系。第3代軟骨細胞培養(yǎng)72h,分別加入含SNP終濃度為1mmol/L10％空白組、對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組的血清DMEM干預(yù)24h,MTT法檢測軟骨細胞活性,Realtime RT-PCR檢測軟骨細胞Bax、Bcl-2、Caspase-9、C

4、aspase-3 mRNA基因表達。
　　 4.第3代軟骨細胞同步化,分別加入含10％空白組、對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組的血清DMEM干預(yù)72h,MTT法觀察軟骨細胞的增殖;免疫組化染色分析軟骨細胞基質(zhì)中Ⅱ型膠原的表達,Realtime RT-PCR檢測軟骨細胞基質(zhì)中CollagenⅡ、PG、Aggrecan、CathepsinK mRNA基因表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代、第2代、第3代軟骨細胞

5、生長狀況良好,甲苯胺藍染色,胞漿內(nèi)見紫紅色異染顆粒,Ⅱ型膠原免疫組化染色,胞漿被染成棕黃色,胞核不著色;至第4代,軟骨細胞發(fā)生梭形變,軟骨細胞特有表型開始丟失。增殖曲線上,第2、3代軟骨細胞生長旺盛,活性比第4、5代軟骨細胞高,尤其是第3代軟骨細胞。
　　 2.透骨消痛膠囊含藥血清干預(yù)后,軟骨細胞OD值,干預(yù)72h明顯高于干預(yù)24h、48h、96h(P＜0.05);10％含藥血清濃度組明顯高于5％、20％含藥血清濃度組(P＜0.

6、01)。確定72h為有效作用時間,10％為有效作用濃度。
　　 3.干預(yù)24h,SNP誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡的有效作用濃度為1mmol/L;含藥血清干預(yù)24h,軟骨細胞OD值,對照組、實驗2組、實驗3組明顯高于空白組(P＜0.05);軟骨細胞Bcl-2mRNA表達,對照組、實驗組明顯高于空白組(P＜0.05);軟骨細胞Bax、Caspase-9、Caspase-3mRNA表達,對照組、實驗組明顯低于空白組(P＜0.01)。
　　

7、 4.在10％含藥血清濃度的作用下干預(yù)72h,第3代軟骨細胞OD值,透骨消痛膠囊實驗組明顯高于空白組(P＜0.01),實驗2組增殖效果最明顯(P＜0.05);Ⅱ型膠原免疫組化染色,透骨消痛膠囊實驗組Ⅱ型膠原表達強于空白組及對照組;CollagenⅡ、PG、AggrecanmRNA基因表達,透骨消痛膠囊實驗組明顯升高(P＜0.01),其中實驗2組升高最顯著(P＜0.01);CathepsinKmRNA基因表達,透骨消痛膠囊實驗組明顯降低

8、(P＜0.01),其中實驗2組降低最顯著(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.透骨消痛膠囊含藥血清干預(yù)軟骨細胞活性的有效作用時間為72h,有效作用濃度為10％。
　　 2.透骨消痛膠囊含藥血清能加速軟骨細胞增殖,維持軟骨細胞活性,其促進軟骨細胞增殖與藥物濃度有關(guān),以中劑量藥物濃度(含透骨消痛膠囊29mg/d)為最佳。
　　 3.透骨消痛膠囊含藥血清能下調(diào)軟骨細胞促凋亡基因Bax、Caspase-9、