1、目的：
　　 凝血因子Ⅻ(FⅫ)，亦稱為Hageman因子，是內(nèi)源性凝血途徑的啟動因子，屬于凝血接觸相蛋白。與其他凝血因子缺陷不同，即使是嚴(yán)重的遺傳性FⅫ缺乏者，臨床上僅有活化部分凝血活酶時間(APTT)延長，而無明顯的出血表現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得人們對遺傳性FⅫ缺陷癥患者分子水平的認(rèn)識更加深入。近年來國內(nèi)外學(xué)者報道了許多FⅫ缺陷的新突變位點，這些突變位點的發(fā)現(xiàn)為FⅫ缺陷癥患者發(fā)病機制的研究提供了分子基礎(chǔ)。本文對一個

2、遺傳性凝血因子Ⅻ缺陷癥家系進(jìn)行FⅫ表型診斷及DNA分子水平的研究，旨在探討FⅫ缺陷癥的分子發(fā)病機制。
　　 方法：
　　 1、資料
　　 先證者，女，67歲，因“急性農(nóng)藥中毒”就診，常規(guī)凝血功能檢查發(fā)現(xiàn)APTT108.1s/35s，血漿凝血酶原時間(PT)13.2s/12s，凝血因子檢查發(fā)現(xiàn)FⅫ活性(FⅫ：C)僅為1％，F(xiàn)Ⅻ抗原(FⅫ：Ag)含量為1.21％；其他凝血因子活性分別為FⅧ:C為300％，F(xiàn)Ⅸ：C為9

3、2％，F(xiàn)Ⅺ：C為113％。經(jīng)檢查初步診斷為FⅫ缺陷癥、急性農(nóng)藥中毒。先證者肝腎功能正常，平素?zé)o明顯出血癥狀，無長期服用藥物史，詢問其家系成員均無出血史。先證者父母非近親結(jié)婚。該家系共8名成員。
　　 2、標(biāo)本的采集、處理和DNA提取
　　 在征得先證者及其家系成員知情同意后，采集靜脈血，以109mmol/L枸櫞酸鈉1：9抗凝，4℃3000r/min離心15min，取乏血小板血漿，分裝，-70℃保存。用非離心柱型血液基因組

4、DNA提取試劑盒抽提家系所有成員外周血單個核細(xì)胞的基因組DNA，-70℃保存待用。
　　 3、凝血象檢測
　　 APTT、PT、FⅧ:C、FⅨ：C、FⅪ:C、FⅫ：C檢測試劑采用法國STAGO公司試劑盒，儀器為STA-R血凝儀，均采用一期凝固法檢測；FⅫ：Ag檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA);所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。
　　 4、基因分析
　　 根據(jù)FⅫ基因序列(GenBankAF5386

5、91)，應(yīng)用primer5軟件共設(shè)計7對引物以覆蓋FⅫ基因的所有外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列。在PCR擴增儀(ABIThermlcycler2720，USA)上進(jìn)行普通擴增；以及為了減少非特異性擴增條帶，7，8和9，10號外顯子的擴增均采用touchdownPCR(TDPCR)。PCR產(chǎn)物5μl在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳，用Goldview標(biāo)記PCR產(chǎn)物大小。PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化(上海桑尼生物科技有限公司膠純化回收試劑盒)，以制備測序模板

6、，采用Sanger雙脫氧鏈終止法在ABI3730XL測序儀上進(jìn)行測序，用Chromas軟件和DNAMAN軟件將測序結(jié)果與美國NCBI基因庫所公布的FⅫ基因序列(GenBankAF538691)進(jìn)行比對(Blaster)，尋找突變基因。
　　 結(jié)果：
　　 1、遺傳性FⅫ缺陷癥家系凝血象檢測結(jié)果
　　 先證者APTT明顯延長，為108.1s/35s;先證者二女兒APTT稍延長，為46.2s/35s;家系其他成員AP

7、TT在正常參考范圍內(nèi)。先證者FⅫ活性嚴(yán)重減低，為1％，其FⅫ：Ag水平為1.21％，表現(xiàn)為交叉反應(yīng)物質(zhì)(CRM)陰性。而該家系其他成員均表現(xiàn)為交叉反應(yīng)物質(zhì)(CRM)陽性，即FⅫ：C為低水平，而FⅫ：Ag在正常參考范圍內(nèi)。其中大女兒、二女兒、大外甥女的FⅫ：C分別為22％、15％、16％，F(xiàn)Ⅻ：Ag分別為115.20％、101.70％、147.50％(通過克隆測序，他們均存在與先證者相同的多態(tài)性位點及缺失突變位點)；大兒子、二孫女、小外甥

8、女的FⅫ：C和FⅫ：Ag分別為24％、15％、15％和177.40％、125.40％、128.60(通過DNA分析，他們均存在與先證者相同的46位多態(tài)性位點T/T型)。
　　 2、遺傳性FⅫ缺陷癥家系基因分析
　　 對該遺傳性FⅫ缺陷癥家系成員所有14個外顯子及側(cè)翼序列進(jìn)行PCR擴增，純化擴增產(chǎn)物后，進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先證者、其大兒子、大女兒、二女兒、二孫女、大外甥女和小外甥女的啟動子區(qū)46位多態(tài)性均為46T/T型，僅

9、小孫女的該位點多態(tài)性表現(xiàn)為46C/T型。另外，通過克隆測序發(fā)現(xiàn)先證者、大女兒、二女兒、大外甥女于9號外顯子均存在6800-6808delAGCTGGGAG，排除基因多態(tài)性，該缺失尚未見國內(nèi)外報道。
　　 結(jié)論：
　　 1、該家系大部分成員存在最為常見引起FⅫ：C下降的46T/T型多態(tài)性位點。
　　 2、先證者、大女兒、二女兒、大外甥女于9號外顯子6800-6808delAGCTGGGAG，該缺失位點尚未見國內(nèi)外報