1、microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼的單鏈RNA分子，可通過(guò)引發(fā)靶mRNA的降解或/和翻譯抑制來(lái)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。這類小分子RNA經(jīng)常以組織特異性或發(fā)育時(shí)期特異性的方式表達(dá)，在調(diào)節(jié)組織/細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡和功能等方面起了重要的作用。miRNA廣泛存在于多細(xì)胞生物中。根據(jù)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)，在哺乳動(dòng)物中miRNA種類總數(shù)估計(jì)可達(dá)1000以上。然而，現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中經(jīng)實(shí)驗(yàn)鑒定的miRNA為700余種，其中絕大部分都

2、是在系統(tǒng)進(jìn)化上高度保守。最近的研究已表明在高等生物中存在著大量非保守的miRNA。因此，繼續(xù)開展新的miRNA的實(shí)驗(yàn)鑒定及其功能研究具有重要的意義。 本論文研究以成年大鼠為模式，建立哺乳動(dòng)物miRNA研究的平臺(tái)。通過(guò)分離了成年大鼠的不同組織中大約22核苷酸左右的小分子RNA，構(gòu)建了小分子RNA的cDNA文庫(kù)。該文庫(kù)有效地排除了細(xì)胞中rRNA和tRNA的干擾，文庫(kù)中miRNA的克隆比率高達(dá)65％，且很多miRNA家族的多個(gè)成員都

3、被檢測(cè)到。無(wú)論是在miRNA的豐度還是種類的多樣性方面，本論文研究構(gòu)建的cDNA文庫(kù)都已經(jīng)達(dá)到國(guó)際同類研究的先進(jìn)水平。 通過(guò)對(duì)文庫(kù)的測(cè)序和篩選，我們從2000多個(gè)克隆子中共鑒定了135個(gè)不同的miRNA。這135種不同的miRNA分子中，104種與已知大鼠miRNA匹配，覆蓋了miRBase(8.0版本)(http：//microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences)注冊(cè)的大鼠miRNA(234

4、)的44％；16種miRNA未在大鼠miRbase中注冊(cè)；15種是最新鑒定的miRNA。大部分新的miRNA在系統(tǒng)進(jìn)化上的保守度很低。對(duì)新的miRNA在腦、心臟、睪丸等7種組織中的表達(dá)譜分析表明，除了一個(gè)非保守的miRNA(暫時(shí)命名為miR-665)在鼠類的7種組織中都有表達(dá)外，其余的10種miRNA呈現(xiàn)組織特異性/限制性表達(dá)。 通過(guò)對(duì)新miRNA的基因座位和組織形式的分析發(fā)現(xiàn)，三個(gè)睪丸特異的新miRNA基因位于大鼠X染色體上

5、相距小于15kb，組成了一個(gè)只在鼠類中高度保守的miRNA基因簇。還有一個(gè)新miRNA和一個(gè)已知的H/ACAboxsnoRNA(RBI-36)由腦特異的5-羥色胺2C受體基因(5-serotonin2Creceptorgene)的同一個(gè)內(nèi)含子編碼，構(gòu)成了一個(gè)內(nèi)含子基因簇。而且它們的基因座位在小鼠和人類中都高度保守。這是目前首次發(fā)現(xiàn)的保守的內(nèi)含子miRNA+snoRNA基因簇。這種基因組織形式表明內(nèi)含子可以編碼多種非編碼RNA等功能元件，

6、同時(shí)也意味著miRNA、snoRNA、mRNA的共表達(dá)、共調(diào)控和可能的協(xié)同功能網(wǎng)絡(luò)。 miR-665在大鼠7種組織中的均一性表達(dá)引起了我們的注意，進(jìn)一步的序列分析發(fā)現(xiàn)其與大鼠基因組完全匹配的基因位點(diǎn)緊鄰于tRNAArg的3'末端。這個(gè)tRNAArg基因包含了PolⅢ轉(zhuǎn)錄所必須的啟動(dòng)子和終止子，意味著miR-665可能與tRNAArg基因一起表達(dá)。RT-PCR結(jié)果驗(yàn)證了miR-665與tRNAArg的共轉(zhuǎn)錄。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示mi

7、R-665與其下游序列能被折疊成一個(gè)短的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，miR-665位于莖環(huán)的5'臂上。tRNAArg-miR-665基因只在小鼠中高度保守，且在小鼠多種組織中表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了tRNA-miR-665基因的存在。該基因的雙順反子轉(zhuǎn)錄前體可能由RNaseZ加工成miRNA前體和tRNA。顯然，這是一種新的哺乳動(dòng)物miRNA生物合成途徑。PolⅢ轉(zhuǎn)錄的miRNA以前僅在小鼠γ-皰疹病毒68(mousegammaherpesvirus，MHV6

8、8)中被發(fā)現(xiàn)，推測(cè)可能與該病毒侵染宿主各類細(xì)胞的能力相關(guān)。那么哺乳動(dòng)物中組成型表達(dá)的miRNA在細(xì)胞中起什么作用呢?有趣的是，miR-665的一個(gè)預(yù)測(cè)的靶基因編碼MHV68中的單鏈DNA結(jié)合蛋白。PolⅢ轉(zhuǎn)錄的miRNA的發(fā)現(xiàn)及其組成型表達(dá)可能揭開哺乳動(dòng)物miRNA在細(xì)胞中新的調(diào)控功能。 除了在基因組織形式方面的特征，幾種新的miRNA被發(fā)現(xiàn)位于疾病相關(guān)的基因位點(diǎn)，靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示大部分新的miRNA的靶基因與疾病特別是腫瘤