1、抑制巨噬細(xì)胞(Mφ)的吞噬體與溶酶體融合是結(jié)核分枝桿菌(Mtb)逃避免疫系統(tǒng)殺傷和在機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏的主要機(jī)制。近年的研究發(fā)現(xiàn),Mtb感染后可誘導(dǎo)Mφ內(nèi)的一種富含色氨酸天冬氨酸膜蛋白(Tryptophan-aspartate containingcoat protein,TACO)迅速分布并局限于含活Mtb的吞噬體的膜上,阻斷Mtb吞噬體與溶酶體的融合。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),TACO是被吞噬的Mtb在Mφ內(nèi)生存必不可少的條件,阻斷TACO的表

2、達(dá)可有效促進(jìn)Mψ吞噬體與溶酶體的融合,從而提高巨噬細(xì)胞殺傷和清除Mtb的能力。因此,通過(guò)某種有效而特異的手段抑制Mφ內(nèi)TACO的表達(dá)可能是一種清除體內(nèi)Mtb最為直接和有效的辦法。本研究構(gòu)建了MφTACO基因特異性小干擾RNA(siRNA)的真核表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)特異性RNAi(RaNA interference,RNAi)抑制Mφ內(nèi)TACO的表達(dá),并且利用經(jīng)過(guò)基因改造的恥垢分枝桿菌Msl-2c作為載體,使其在Mφ內(nèi)定位表達(dá)TACOmRNA特

3、異性的siRNA,通過(guò)RNA干擾技術(shù)高效特異地抑制TACO表達(dá),從而清除體內(nèi)的Mtb,為進(jìn)一步利用siRNA研究基因的功能及治療結(jié)核病奠定了基礎(chǔ)。
　　 第一部分 TACO特異性siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 目的:構(gòu)建針對(duì)TACO基因的特異性siRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒,為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:參照invitrogen公司在線設(shè)計(jì)siRNA軟件設(shè)計(jì)三對(duì)互補(bǔ)的單鏈DNA,包括siRNA的正義鏈和反義鏈

4、,并且設(shè)計(jì)了一組對(duì)照序列。在互補(bǔ)單鏈中間連有l(wèi)oop環(huán),loop環(huán)兩側(cè)為21bp的以正反向組合的干擾序列,兩端為BamHⅠ和BbsⅠ酶切位點(diǎn)的粘性末端。針對(duì)這些篩選的siRNA序列,合成該序列的OligoDNA,經(jīng)退火形成雙鏈DNA,與經(jīng)BamHⅠ和BbsⅠ雙酶切后的pGPU6/GFP/Neo載體連接,構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-taco(簡(jiǎn)稱pST)干擾質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,挑取重組陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定。
　　

5、結(jié)果:經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí),siRNA核苷酸序列正確插入到表達(dá)載體p(GPU6/GFP/Neo中,成功構(gòu)建了TACO基因特異性的siRNA表達(dá)質(zhì)粒pST1、pST2、pST3及對(duì)照siRNA表達(dá)質(zhì)粒pST4。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了針對(duì)TACO基因干擾序列的表達(dá)載體pST。
　　 第二部分 siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及其抑制 TACO表達(dá)效果的檢測(cè)
　　 目的:將干擾質(zhì)粒pST1、pS

6、T2、pST3和對(duì)照質(zhì)粒pST4轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264-7和293T細(xì)胞,在細(xì)胞水平檢測(cè)TACO的表達(dá)變化。
　　 方法:采用RT-PCR方法自小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7中擴(kuò)增獲取taco基因片段,并將之克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pQE30中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-taco。以pQE30-taco作為標(biāo)準(zhǔn)物建立熒光定量PCR法檢測(cè)taco基因水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在此基礎(chǔ)上,本部分研究采用了三種不同的方法對(duì)taco特異性siRN

7、A表達(dá)質(zhì)粒對(duì)巨噬細(xì)胞TACO表達(dá)的影響進(jìn)行了研究:(1)采用pST1、pST2、pST3、pST4轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7,分別采用熒光定量RT-PCR和免疫印跡法在mRNA和蛋白水平檢測(cè)巨噬細(xì)胞的TACO表達(dá)變化。但由于RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下,pST1、pST2、pST3、pST4轉(zhuǎn)染后熒光定量RT-PCR和免疫印跡法均未檢測(cè)到TACO的表達(dá)有明顯的改變。(2)采用pST1、pSY2、pST3、pST4轉(zhuǎn)染小鼠巨噬

8、細(xì)胞系RAW264.7,然后以TACO特異性抗體為一抗,紅色熒光蛋白標(biāo)記的二抗對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,在單細(xì)胞水平比較獲pST質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(表達(dá)綠色熒光蛋白)和未獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的紅色熒光的熒光強(qiáng)度,評(píng)價(jià)siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)TACO表達(dá)的影響。(3)利用293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高,本身不表達(dá)TACO的特點(diǎn),構(gòu)建TACO與紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)基因的融合基因表達(dá)質(zhì)粒:pCDNA3.1-Red-taco(簡(jiǎn)稱p3.1-RT),用p3.1-RT和TA

9、CO特異性siRNA表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,再采用免疫印跡方法檢測(cè)TACO的表達(dá)改變。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后熒光定量PCR和western blot圖片表明沒有明顯的差異。在pST干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后用TACO蛋白做細(xì)胞免疫熒光表明細(xì)胞內(nèi)TACO表達(dá)明顯的降低。在293T細(xì)胞中,在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)到了TACO的變化。
　　 結(jié)論:pST干擾質(zhì)?？墒箃aco mRNA及蛋白水平表達(dá)下降。<

10、br>　　 第三部分重組恥垢分枝桿菌菌苗rMs-pSTM的構(gòu)建及鑒定
　　 目的:利用經(jīng)過(guò)基因改造的恥垢分枝桿菌Msl-2c作為載體,靶向遞送小干擾。RNA的真核表達(dá)質(zhì)粒,觀察其靶向性。
　　 方法:將分枝桿菌的復(fù)制子ORIM用分子克隆的方法連入siRNA表達(dá)質(zhì)粒pST1-4中,得到pSTM1-4,然后電穿孔入Ms1-2c中,構(gòu)建可靶向遞送pSTM1-4質(zhì)粒進(jìn)入Mφ中進(jìn)行表達(dá)的重組恥垢分枝桿菌rMs-pSTM1-4并用