1、目前,基因治療在腫瘤治療方面已經取得了較大進展,RNA干擾(RNAinterference)技術作為腫瘤基因治療的一個主要的手段已經得到廣泛的關注和研究,但是由于非靶基因治療限制了其在臨床方面的應用,如何將靶基因準確地傳遞至靶部位成為該領域研究的一個重要的突破口。為了確保治療基因傳遞至靶細胞而不傷害到正常細胞或者其它組織器官,目前靶向性載體轉錄、特異性啟動子、自殺基因療法等方式已經在各自的研究領域里取得了一定的進展。本研究采用組織特異性

2、啟動子誘導shRNA在肝臟中特異性表達的方式來實現(xiàn)肝癌基因治療的靶向性。
　　 首先,我們選擇了人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)作為治療的靶點。hTERT在大部分惡性腫瘤中表達,在正常組織中不表達,并且多項研究表明hTERT是腫瘤細胞永生化主要促因,hTERT表達的下調對腫瘤細胞的發(fā)展有抑制作用,這使得hTERT成為腫瘤基因治療的一個理想的靶標。由此,我

3、們設計了4個不同的shRNA干擾片段,并在pRS載體上由U6啟動子調控表達,分別命名為pRS-shT1、pRS-shT2、pRS-shT3、pRS-shT4。另外設計一個陰性對照載體,該載體的shRNA片段的29nt靶序列中含有一段無意義片段,也就是非靶向hTERT基因片段,命名為pRS-shT5。通過瞬時轉染和穩(wěn)定篩選等實驗,對其抑制率進行了評估,最終選出在肝癌細胞SMMC-7721中對hTERT抑制效果最好的shRNA干擾片段。

4、r>　　 其次,本研究采用apoA-I核心啟動子實現(xiàn)RNAi的肝組織特異性,為了增強RNAi效果,采用原核增強子的修飾方式增強apoA-I啟動子的轉錄活性。我們選用了CMV(人巨細胞病毒基因)和SV40(猴空泡病毒40,猿猴病毒40或猴病毒40)增強子。
　　 最后,由修飾后的apoA-I啟動子啟動該片段的表達,并且為了避免RNA聚合酶Ⅱ啟動子引起的脫靶效應,將Ribozyme和MAZ結構應用于shRNA干擾載體上,Riboz

5、yme和MAZ結構避免脫靶效應的功能在本實驗室前期工作中已得到確證,在獲得一個完整的肝靶向RNA干擾表達載體之后,評價此肝靶向的RNA干擾表達載體的效果。
　　 此外,大量研究表明,表皮生長因子受體EGFR,在肝癌細胞中EGFR信號的平均表達量是正常肝細胞中的兩倍,EGFR在92％的肝癌細胞細胞膜上都過表達。并據(jù)文獻報道,EGFR本身表達的抑制會抑制腫瘤細胞的發(fā)展,同時EGFR表達的上調會導致hTERT基因表達的上調,故基于上述

6、研究結果,本研究選用了apoA-I啟動子啟動的靶向EGFR基因的RNA干擾表達載體,Western-blot檢測hTERT和EGFR表達載體共轉染是否能夠獲得雙重下調hTERT的效果。
　　 研究結果表明,1)4個shRNA干擾片段均具有不同程度的RNA干擾效果,并且pRS-shT2載體的效果最好,pRS-shT2的shRNA可以作為進一步研究的靶序列；2)CMV增強子對apoA-I啟動子的修飾顯示出了相對其它增強子的優(yōu)勢,CM