1、研究背景:骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)具有多向分化的潛能，在經(jīng)典研究中，它被認為是骨細胞和成軟骨細胞、成纖維細胞的共同起源細胞，對骨和軟骨的發(fā)生非常重要。體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在合適的環(huán)境和條件下，骨髓間充質(zhì)干細胞能夠在體外進行34-42次的分裂增殖，增殖過程中始終保持梭形并呈漩渦狀排列。不僅如此，骨髓間充質(zhì)干細胞在冷凍保存進行復(fù)蘇后，仍然具備干細胞的特性。BMSCs不僅存在于骨髓中，還游離于骨組織外。當其在適當

2、信號刺激時，可游離出骨組織，到達效應(yīng)靶器官組織中，這種生物學(xué)行為叫“歸巢”。細胞的歸巢能力與細胞周期緊密相關(guān)，且由復(fù)雜分子相互作用才能介導(dǎo)其在骨髓內(nèi)的識別與定植，因此骨髓間充質(zhì)干細胞在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)了良好的前景。
　　脂肪組織是調(diào)節(jié)機體能量平衡的器官，通過調(diào)節(jié)脂肪和糖代謝動態(tài)維持代謝與體溫的穩(wěn)定，而且能夠作為重要的屏障緩沖機械力的沖擊，保護內(nèi)臟。目前，肥胖以及由肥胖造成的代謝疾病在世界范圍內(nèi)對人類健康產(chǎn)生了嚴重的威脅，而這些疾病的

3、出現(xiàn)，與脂肪細胞的分化和功能存在密切關(guān)系。
　　BMSCs分化成脂肪細胞受細胞外信號和轉(zhuǎn)錄水平的級聯(lián)放大調(diào)控，這需要大量基因表達之間的精細時空調(diào)節(jié)。在哺乳動物中過氧化物酶受體激動劑(peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα，C/EBPα)是成脂分化過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。PPARγ

4、在前體脂肪細胞向脂肪細胞分化過程中被誘導(dǎo)，并且在此過程中是必需的。缺少它，前體細胞不能分化為成熟的脂肪細胞，而且PPARγ能夠促進C/EBPα缺失的細胞進行成脂分化。反過來，C/EBPα不能夠促進PPARγ缺失的細胞完成脂肪分化。雖然缺少C/EBPα的細胞能夠完成脂肪分化，但是這個分化細胞是有缺陷的，它們只能聚集少量的脂肪滴，并且不能誘導(dǎo)PPARγ的表達，這指示PPARγ和C/EBPα的相互作用在整個成脂分化過程中的作用非常重要?；诔?/p>

5、脂轉(zhuǎn)錄因子的重要性，現(xiàn)有證據(jù)表明，PPARγ和C/EBPα的激活是由轉(zhuǎn)錄因子、共激活因子和共抑制因子相互作用共同來完成的，其中組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙?；咐眠z傳學(xué)調(diào)控，發(fā)揮著巨大的作用。
　　核受體輔助抑制因子(nuclear receptor corepressor, NCoR)屬于核受體輔助抑制因子家族中的一員，其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用主要是通過募集HDAC，例如HDAC1，HDAC7，HDAC4，HDAC3及Sirt1等，并

6、且已經(jīng)清楚表明HDAC3募集形成的復(fù)合物對甲狀腺受體的轉(zhuǎn)錄抑制功能是必需的。近年來發(fā)現(xiàn)NCoR可以與HDAC結(jié)合成復(fù)合物，通過影響蛋白的轉(zhuǎn)錄，在機體代謝、炎癥以及腫瘤發(fā)生中扮演著重要角色。下調(diào)輔助抑制因子的表達會打破輔助抑制因子和輔助激活因子在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、炎癥以及其他生物進程調(diào)節(jié)中的平衡，進而易化腫瘤的發(fā)生。輔助調(diào)節(jié)因子也可能通過不同調(diào)節(jié)機制在不同類型癌癥或白血病中發(fā)揮著抗腫瘤的作用。另外研究發(fā)現(xiàn)，沉默（或敲除）NCo

7、R基因可以通過增加PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性進而促進3T3-L1細胞的脂肪分化。Pingping LI等特異性沉默小鼠脂肪細胞中NCoR基因，發(fā)現(xiàn)PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性增強，脂肪細胞增生，局部炎癥減輕。近年來，PPARγ被發(fā)現(xiàn)扮演著成脂與成骨分化通路中的分子開關(guān)，PPARγ過表達后會抑制Runx2的表達，從而使間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化。Jackson及其同事發(fā)現(xiàn)高濃度的PPARγ配體可抑制前成骨細胞MC3T3-E1細胞向骨細胞分化，并可通過過

8、表達PPARγ誘導(dǎo)MC3T3-E1細胞分化為成熟的脂肪細胞。研究發(fā)現(xiàn)NCoR可通過GPS2與活化的PPARγ結(jié)合，抑制活化的PPARγ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。NCoR協(xié)同HDAC9抑制PPARγ的活性進而抑制破骨細胞增生，在骨重塑中發(fā)揮重要作用。那么NCoR對骨髓間充質(zhì)干細胞的脂肪分化有何影響呢？本文通過RNA干擾技術(shù)及基因過表達技術(shù)，干擾或過表達BMSC中NCoR基因的表達，觀察BMSC的脂肪細胞分化過程，檢測其中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達，詳細闡述NC

9、oR對骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化的影響。
　　研究目的:構(gòu)建NCoR siRNA和pCMV-NCoR載體，為后續(xù)細胞學(xué)實驗奠定基礎(chǔ)。將NCoR siRNA和pCMV-NCoR轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞，觀察NCoR對BMSCs的生長及增殖的影響，以及和胰島素在BMSCs增殖方面的作用關(guān)系，為BMSCs生長增殖的研究提供一定依據(jù)，并為BMSCs作為種子細胞的移植治療提供實驗基礎(chǔ)。然后將NCoR siRNA和pCMV-NCoR轉(zhuǎn)染BMSCs，

10、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察NCoR對BMSCs成脂分化及增殖的影響，為今后糖脂代謝異常、肥胖等的研究和治療提供一定的實驗理論基礎(chǔ)。
　　研究方法:1、根據(jù)NCoR siRNA靶位點的選擇原則，從GenBank數(shù)據(jù)庫中擇優(yōu)選取三條siRNA序列，通過構(gòu)建干擾及過表達載體，篩選出最佳序列。2、檢測NCoR對BMSCs增殖的影響。在96孔板上按1×106/孔接種大鼠BMSCs，設(shè)置空白對照組、陰性對照組（無目標siRNA）、pCMV-N1、NC

11、oR siRNA和pCMV-NCoR組，每組設(shè)3個復(fù)孔。從轉(zhuǎn)染后第1天開始，每天同一時間消化每組細胞3個孔，連續(xù)5d，細胞計數(shù)器計數(shù)繪制各組細胞的生長曲線圖，MTT法檢測細胞增殖率。3、觀察NCoR和胰島素在大鼠BMSCs增殖過程中的關(guān)系。設(shè)置空白對照組、陰性對照組（無目標siRNA）、pCMV-N1、NCoR siRNA和pCMV-NCoR組，采用0mmol/L、5mmol/L、15mmol/L及45mmol/L濃度的胰島素處理各組細

12、胞3d后，細胞計數(shù)器和MTT法分別檢測細胞的生長與增殖，評估NCoR和胰島素在大鼠BMSCs增殖過程中的作用關(guān)系。
　　研究結(jié)果:1、成功構(gòu)建了NCoR siRNA及pCMV-NCoR質(zhì)粒載體，并篩選了最佳干擾序列，載體由廣州Cyagen生物科技公司合成。2、NCoR siRNA可使BMSCs的增殖降低。與對照組相比，第1d三組細胞數(shù)量差異不大。從第3d開始，NCoRsiRNA組細胞數(shù)量及增殖明顯低于對照組，而pCMV-NCoR組

13、細胞數(shù)量及增殖明顯高于對照組。倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與對照組相比，NCoR siRNA及pCMV-NCoR組大鼠BMSCs的形態(tài)無明顯差別，提示NCoR可促進BMSCs增殖。3、NCoR siRNA可減弱胰島素對BMSCs增殖的促進作用。5mmol/L濃度的胰島素促進了細胞生長及增殖，但作用不明顯，15mmol/L濃度的胰島素明顯增加了BMSCs的生長與增殖率，但45mmol/L濃度的胰島素不能促進細胞的生長及增殖。NCoR基因沉默后

14、，不同濃度胰島素對BMSCs細胞生長與增殖影響均減弱。而過表達NCoR后，各種濃度胰島素對BMSCs的細胞生長及增殖作用均得到加強。4、NCoR siRNA可促進大鼠BMSCs成脂分化后細胞增殖。與對照組相比，NCoR siRNA組的增殖明顯增強，而NCoR過表達組的增殖則明顯降低(P＜0.05)。NCoR過度表達導(dǎo)致細胞活性顯著下調(diào)只是在特定的時間，而不呈現(xiàn)時間依賴性。5、NCoR負性調(diào)控大鼠BMSCs的成脂分化。與對照組相比，NCo

15、R siRNA組細胞內(nèi)的脂肪滴明顯增加。對其增殖的檢測顯示，NCoR siRNA組的OD值顯著高于對照組。此外，Western blot和實時RT-PCR對脂肪分化相關(guān)的三個基因PPARγ、C/EBPα與LPL的檢測顯示，與對照組相比，NCoR siRNA組C/EBPα、PPARγ包括PPARγ1與PPARγ2蛋白表達上調(diào)(P＜0.05)，LPL mRNA表達也顯著增加(P＜0.01)。而NCoR過表達組細胞內(nèi)脂滴的積累明顯減少。NCo

16、R過表達明顯抑制了細胞的增殖。pCMV-NCoR組C/EBPα、PPARγ包括PPARγ1與PPARγ2和LPL mRNA表達顯著降低(P＜0.01)。
　　研究結(jié)論:我們利用RNA干擾技術(shù)成功設(shè)計并構(gòu)建了NCoR基因特異性的小干擾siRNA，以及設(shè)計并構(gòu)建了NCoR基因過表達質(zhì)粒。經(jīng)證實，基因沉默或過表達效果良好。我們成功將NCoR siRNA和pCMV-NCoR轉(zhuǎn)染至大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)，并證實轉(zhuǎn)染效率較高。然后檢測BMSC

17、s的增殖發(fā)現(xiàn)，NCoR siRNA組BMSCs的增殖速率明顯下降，提示NCoR可促進BMSCs的增殖。BMSCs在不同胰島素濃度下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)15mmol/L濃度的胰島素明顯增加了BMSCs的生長與增殖率，而NCoR基因沉默后，不同濃度胰島素對BMSCs細胞生長與增殖影響均減弱。但是過表達NCoR后，各種濃度胰島素對BMSCs的細胞生長及增殖作用均得到加強。這提示NCoR和胰島素在大鼠BMSCs的生長及增殖過程中存在一定的作用關(guān)系。沉默N