1、黃成G D N F 干預(yù)骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究 三G D N F 干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究中文摘要目的比較膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( G D N F ) 與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( B D N F ) 在誘導(dǎo)骨髓陽J 充質(zhì)十細(xì)胞( B M S C s ) 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的差異性，繼以載G D N F 、綠色熒光蛋白( G F P ) 基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染B M S C s ，觀察轉(zhuǎn)染后G D N F 基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況

2、及對細(xì)胞生長、分化的影響。方法采用全骨髓貼壁法聯(lián)合連續(xù)半換液法獲取B M S C s ，流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行鑒定細(xì)胞表型分子。分別制備含G D N F ( 濃度為1 0 n g ／m 1 ) 及B D N F ( 濃度為1 0 n g ／m 1 ) 培養(yǎng)液誘導(dǎo)B M S C s ，體外誘導(dǎo)B M S C s 分化3 天后，免疫熒光技術(shù)檢測各誘導(dǎo)組中細(xì)胞對神經(jīng)元烯醇化酶( N S E )的表達(dá)情況，誘導(dǎo)細(xì)胞分化5 天后，免疫熒光技術(shù)檢測微管蛋

3、白一2 ( M A P - 2 ) 的表達(dá)情況，誘導(dǎo)7 天后觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況，計(jì)算轉(zhuǎn)化率并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，誘導(dǎo)9 天后觀察各誘導(dǎo)組中B M S C s 對N S E 與M A P 一2 共表達(dá)情況，并在誘導(dǎo)過程中以M T T法分析誘導(dǎo)組中細(xì)胞活力的變化情況，將各檢測指標(biāo)與空白對照組比較，收集數(shù)據(jù)并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。進(jìn)一步采用載r G D N F —G F P 基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染B M S C s ，轉(zhuǎn)染后不同檢測時(shí)間點(diǎn)

4、觀察轉(zhuǎn)染效果，測算轉(zhuǎn)染效率，并評估轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力變化情況，并與未轉(zhuǎn)染對照組比較，收集數(shù)據(jù)并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中，轉(zhuǎn)染5 天、1 0 天后P C R 檢測r G D N F 基因在B M S C s內(nèi)的表達(dá)情況，并分別在轉(zhuǎn)染后5 、1 0 天后觀察轉(zhuǎn)染組中B M S C s 對N S E 、M A P 一2 的表達(dá)情況，并與對照組比較。結(jié)果全骨髓貼壁法結(jié)合連續(xù)半換液法可獲取純度高、活力好、形態(tài)較為統(tǒng)一的貼壁細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)鑒定結(jié)果表明該貼

5、壁細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。外源性G D N F 和B D N F 可誘導(dǎo)B M S C s 表達(dá)N S E 、M A P 一2 ，但在G D N F 誘導(dǎo)后B M S C s 活力較高，細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變趨勢亦更為顯著，此外G D N F 可對B M S C s 維持較長時(shí)間分化狀態(tài)，較B D N F 誘導(dǎo)組與空白對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。載r G D N F ．G F P 基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染B M S C s 后，目的基因G F P

6、 的表達(dá)隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)，于轉(zhuǎn)染后7 2 h 接近表達(dá)高峰，之后逐漸下降。P C R 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后B M S C s 對G D N F 的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，M T T 檢測結(jié)果提示載r G D N F ．G F P基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染B M S C s 5 天后后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力較對照組顯著提高，并存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，P C R 檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染1 0 天后B M S C s 對G D N F 的表達(dá)較轉(zhuǎn)染后5 天明顯增強(qiáng)。免疫熒光技

7、術(shù)鑒定結(jié)果表明載r G D N F —G F P 基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染B M S C s5 天后，細(xì)胞對N S E 陽性表達(dá)，1 0 天后對M A P 一2 陽性表達(dá)。結(jié)論G D N F 與B D N F 可在體外誘導(dǎo)B M S C s 表達(dá)神經(jīng)樣細(xì)胞標(biāo)志性蛋白分子，但G D N F黃成G D N F 干預(yù)骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究E x p e r i m e n t i a l s t u d y f o rd i f f e r

8、 e n t i a t i o n o f b o n e m a r r o ws t e m s c e l l si n d u c e d b y G D N FA B S T R A C T3A i m sC o m p a r i n gt h ed i f f e r e n c e s o fd i f f e r e n t i a t i o no fb o n em a r r o wm e s e n c h

9、y m a ls t e m c e l l s( B M S C s ) i n d u c e di n t o n e u r o n —l i k e c e l l s b yu s i n gg l i a l c e l l l i n e —d e r i v e d n e u r o t r o p h i c f a c t o r( G D N F ) a n d b r a i n —d e r i v e d

10、n e u r o t r o p h i cf a c t o r ( B D N F ) ，f u r t h e rt os e tG D N F —G F P r e c o m b i n a n ta d e n o v i r n sv i r u s t r a n s f e c t e d B M S C s ，o b s e r v i n gt h e e x p r e s s i o n o fG D N F

11、a n dG F Pg e n e i nB M S C s a n d g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o no f t h e B M S C s a f t e rt r a n s f e c t i o nM e t h o d sI s o l a t i n g a n dc h a r a c t e r i z i n g p u t a t i v e b o

12、n e m a r r o wd e r i v e dM S C sf r o m t h e S p r a 。g u e - D a w l e y ( S D ) r a t s ．F u r t h e r m o r e ，d i f f e r e n t i a t i o n e f f e c t s w e r e c o m p a r e d b e t w e e nG D N F —i n d u c i

13、n gg r o u p a n d B D N F —i n d u c i n gg r o u p ．O f t h e s e ，B M S C sw e r ei s o l a t e df r o mt h eS Dr a t si n a t r a d i t i o n a lm a n n e r ，a n di d e n t i f i e db a s e d o np l a s t i ca d h e

14、r e n c e ，m o r p h o l o g y , a n d s u r f a c ep h e n o t y p e a s s a y s ．B e s i d e s ，i n G D N F —i n d u c i n g g r o u p ( i n c l u d i n g 1 0 n g ／m l G D N F ) a n dB D N F —i n d u c i n gg r o u p (

15、 i n c l u d i n g10 n g ／m lG D N F ) ，m a k e r so f n e u r a l —l i k ec e l l s ，s u c ha sN S E a n dM A P - 2 ，w e r e d e t e c t e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c ea n d W e s t e r n b l o t t i n g a td

16、i f f e r e n tt i m e —p o i n t ．I na d d i t i o n ，c h a n g e so f s i g n i f i c a n tn e u r a l —l i k e c e l l sm o r p h o l o g ya n dc e l lv i a b i l i t yo fB M S C s w e r eo b s e r v e d a n d a n a l

17、 y z e d b ys t a t i s t i c a lm e t h o d d u r i n gt h ei n d u c t i o n w i t hG D N F a n d B D N F ．I n a d —d i t i o n ，B M S C sw e r e t r a n s f e c t e dw i t hr e c o m b i n a n t a d e n o v i r u sc o

18、 n t a i n i n gt h eG D N F a n d g r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n ( G F P ) g e n e s ．T h ee x p r e s s i o no fG F P w a s o b s e r v e db yf l u o r e s c e n c em i c r o —s c o p e a n d t h ee x p r

19、 e s s i o no f G D N F W a sd e t e c t e db yP C R a f t e rt r a n s f e c t i o n ．M T Ta s s a y sw e r ee m p l o y e d t od e t e r m i n et h ec y t o t o x i c i t yo f t h et r a n s f e c t i o na g a i n s tB

20、 M S C s i nv i t r o ．T h ee x p r e s —s i o no f N S E a n d M A P - - 2f r o mB M S C s w e r ed e t e c t e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c ea n d W e s t e r n b l o t ·-t i n ga td i f f e r e n tt i m

21、e —p o i n t a f t e r t r a n s f e c t i o n ．R e s u l t sT h er e s u l to f t h i s r e s e a r c h e si n d i c a t et h a tw h o l e m a r r o w d i r e c ta d h e r e n c ew a s a s i m p l ea n d c o n v e n i e

22、 n t m e t h o d f o ri s o l a t i o na n dc u l t i v a t i o n o f B M S C s ．B M S C s c o u l d e x p r e s sm a k e r o fn e u r o n sa n dc h a n g e i n t o s i g n i f i c a n t m o r p h o l o g yo fn e u r a l

23、 —l i k e c e l l sb y u s i n gG D N F , w h i c hc o u l da c h i e v em o r ep e r s i s t e n ta n ds t a b l ei n d u c i n g e f f e c tt h a nB D N F i nv i t r o ．T h er e s u l t o f f l u o —r e s c e n c e m i

24、 c r o s c o p ei n d i c a t e dt h a tt h e e x p r e s s i o no f G F P g r a d u a l l yi n c r e a s e du n t i l3 d a y sa f t e rt r a n s f e c t i o na n d t h eG F P c o u l d b eo b s e r v e d u n t i l 14d a