1、本實(shí)驗(yàn)的目的是研究PCDH8基因在卵巢癌中的表達(dá)水平及臨床意義，并對進(jìn)一步的機(jī)制研究進(jìn)行初步的探索。本實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法及組織芯片技術(shù)檢測PCDH8蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PCDH8蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與患者臨床特征及預(yù)后之間存在緊密的聯(lián)系，隨后我們在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)PCDH8在卵巢癌中的作用，并且擬從臨床腫瘤組織標(biāo)本、體外細(xì)胞系和體內(nèi)移植瘤模型三個層面系統(tǒng)、全面的研究PCDH8在卵巢癌中發(fā)生發(fā)展的功能和調(diào)控機(jī)制，為PCD

2、H8作為卵巢癌精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。
　　第一部分 PCDH8在卵巢癌中的表達(dá)及其和臨床預(yù)后的關(guān)系
　　目的:
　　研究PCDH8蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)及其和臨床特征與預(yù)后的關(guān)系，初步探索PCDH8在卵巢癌疾病進(jìn)展中的作用。
　　方法:
　　1.應(yīng)用Western Blot方法檢測PCDH8蛋白在8對卵巢癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，分析PCDH8在卵巢癌和正常組織的表達(dá)差異;
　　2.

3、應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法及組織芯片技術(shù)檢測PCDH8蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，并且分析PCDH8蛋白表達(dá)強(qiáng)度與患者臨床特征及生存預(yù)后之間的關(guān)系。
　　3.數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS23.0(SPSS軟件，美國IBM公司)進(jìn)行統(tǒng)計分析。研究結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)值類變量比較采用配對或非配對t檢驗(yàn)。臨床病理特征單因素分析采用卡方檢驗(yàn)，將單因素中有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)的變量帶入多因素COX回歸分析模型進(jìn)行多因素分析。生存分析應(yīng)用Kapl

4、an-Meier法檢測并應(yīng)用graphpad prism6.0繪制生存曲線，以上所有檢驗(yàn)定義P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.Western Blot方法檢測結(jié)果提示卵巢癌組織中的表達(dá)與癌旁對比，卵巢癌組織中PCDH8表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.PCDH8表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理參數(shù)的單因素和多因素COX回歸分析結(jié)果提示:PCDH8表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后(P=0.0

5、29)、轉(zhuǎn)移(P=0.048)、FIGO分期(P=0.0065)、和復(fù)發(fā)(P=0.0011)明顯相關(guān)，而與年齡、CA-125表達(dá)無明顯相關(guān);PCDH8的低表達(dá)提示卵巢癌預(yù)后不良(P＜0.01)，并且是影響卵巢癌患者總體生存的獨(dú)立風(fēng)險因素。
　　3.Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示PCDH8低表達(dá)的卵巢癌患者的生存時間明顯差于PCDH8高表達(dá)的患者(P＜0.05)，提示PCDH8的表達(dá)和卵巢癌患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。

6、　　結(jié)論:
　　卵巢患者組織中PCDH8的表達(dá)水平和患者臨床惡性表型和生存預(yù)后密切相關(guān)，PCDH8可能參與了卵巢癌的疾病進(jìn)程。
　　第二部分 PCDH8基因?qū)β殉舶┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制
　　目的:
　　探討PCDH8在卵巢癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制，旨在從新的角度闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為尋找新的卵巢癌治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.利用慢病毒技術(shù)在卵巢癌細(xì)胞

7、中過表達(dá)PCDH8基因;
　　2.分別利用RT-PCR、Westernblot檢測PCDH8基因在卵巢癌中的過表達(dá)效率;
　　3.采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)(Wound Healing assay)，檢測PCDH8基因過表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞的遷移能力變化情況。
　　4.采用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell assay)，檢測PCDH8基因過表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的變化情況。
　　5.采用克隆形成實(shí)驗(yàn)(Colony Forma

8、tion)分析檢測PCDH8基因過表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　6.應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究在卵巢癌細(xì)胞中PCDH8基因過表達(dá)后，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組mRNA基因表達(dá)譜變化情況，同時利用生物信息學(xué)進(jìn)行GO分析、KEGG通路分析。
　　7.數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS23.0(SPSS軟件，美國IBM公司)進(jìn)行統(tǒng)計分析。研究結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)值類變量比較采用配對或非配對t檢驗(yàn)。以上所有檢驗(yàn)定義P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　

9、　結(jié)果:
　　1.經(jīng)RT-PCR、Westernblot和免疫熒光技術(shù)檢測驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染PCDH8慢病毒的卵巢癌細(xì)胞中PCDH8基因表達(dá)水平顯著增高，提示PCDH8過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞構(gòu)建成功;
　　2.增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:與對照組的卵巢癌細(xì)胞相比，PCDH8過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞的卵巢癌細(xì)胞的生長被顯著抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　3.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:經(jīng)過48h遷移后，與對照組的卵巢癌細(xì)胞相比，PCDH8

10、過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞的劃痕遷移距離顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:與對照組的卵巢癌細(xì)胞相比，PCDH8過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞侵襲入下層小室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:與對照組的卵巢癌細(xì)胞相比，PCDH8過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞的克隆形成的數(shù)目明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.基因芯片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基

11、因有112個(Fold chang≥2，P＜0.05)，其中基因表達(dá)增高，呈現(xiàn)上調(diào)趨勢者有48個，而基因表達(dá)降低，呈下調(diào)趨勢者有64個。
　　7.對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。差異基因的GO分析，差異表達(dá)基因主要集中在對細(xì)胞凋亡、上皮發(fā)育、多細(xì)胞生物大分子代謝等過程中。
　　結(jié)論:
　　PCDH8過表達(dá)后顯著抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖能力、遷移能力、侵襲能力和克隆形成能力，提示PCDH8在卵巢癌的發(fā)展中可能起到抑癌

12、基因的作用。
　　第三部分 PCDH8對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的裸鼠體內(nèi)研究
　　目的:
　　通過構(gòu)建PCDH8穩(wěn)定過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系，并皮下注射入裸鼠體內(nèi)成瘤，觀察體內(nèi)PCDH8對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　1.將PCDH8穩(wěn)定過表達(dá)組(Lenti-PCDH8)和空病毒對照組(Lenti-mock)的卵巢癌細(xì)胞注入裸鼠皮下，構(gòu)建卵巢癌移植瘤模型，在體內(nèi)觀察PCDH8過表達(dá)對卵巢癌生物

13、學(xué)行為的影響。
　　2.觀察PCDH8穩(wěn)定過表達(dá)組(Lenti-PCDH8)和空病毒對照組(Lenti-mock)裸鼠腫瘤體積和重量的變化，應(yīng)用活體成像技術(shù)檢測移植瘤熒光強(qiáng)度的變化，繪制生長曲線。
　　3.免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測裸鼠腫瘤組織的PCDH8的表達(dá)。
　　4.數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS23.0(SPSS軟件，美國IBM公司)進(jìn)行統(tǒng)計分析。研究結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)值類變量比較采用配對或非配對t檢驗(yàn)，以上所有檢驗(yàn)定義P

14、＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)PCDH8的裸鼠組比轉(zhuǎn)染空病毒組，腫瘤體積和重量減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)PCDH8的裸鼠組比轉(zhuǎn)染空病毒組，移植瘤熒光強(qiáng)度顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)PCDH8的裸鼠組比轉(zhuǎn)染空病毒組，腫瘤細(xì)胞增殖速度降低(P＜0.0

15、5)。
　　結(jié)論:
　　PCDH8過表達(dá)抑制卵巢癌裸鼠移植瘤模型的體內(nèi)的增殖速度，進(jìn)一步確認(rèn)了體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證實(shí)了PCDH8在卵巢癌的發(fā)展中可能起到抑癌基因的作用的功能。
　　全文結(jié)論:
　　1.PCDH8在卵巢癌中表達(dá)明顯降低。PCDH8的異常低表達(dá)和患者轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等臨床惡性表型密切相關(guān)，同時PCDH8高表達(dá)患者的生存時間明顯長于PCDH8低表達(dá)的患者，提示PCDH8在卵巢癌的疾病進(jìn)展中可能起到抑癌基因的作用

16、，可成為惡性臨床表型預(yù)測和判斷預(yù)后的潛在靶點(diǎn)。
　　2.體外研究結(jié)果顯示:PCDH8過表達(dá)后，卵巢癌的增殖能力、遷移能力、侵襲能力以及克隆形成能力明顯下降;在體內(nèi)研究中，PCDH8過表達(dá)對卵巢癌成瘤能力的抑制被進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　3.本研究先后通過體外細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)以及裸鼠體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中PCDH8基因的低表達(dá)，并初步其探究了在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中PCDH8基因的具體作用和可能的機(jī)制，為PCDH8作為卵巢癌精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)提