1、目的:
　　一、通過觀察中藥單體成分白藜蘆醇對BV-2小膠質細胞Aβ吞噬作用和炎癥因子分泌的影響，及其對Trem2蛋白表達及分泌的調節(jié)作用，探討白藜蘆醇作為抗AD藥物研發(fā)的可能性。
　　二、通過觀察過表達PS1對BV-2小膠質細胞吞噬作用的影響及其對Trem2轉運的調控，探討以PS1為間接作用靶點調控Trem2的轉運，增強小膠質細胞對Aβ的吞噬，為抗AD中藥的篩選提供更多的思路。
　　方法:
　　一、白藜蘆醇對B

2、V-2細胞吞噬作用的調控及其機制研究
　　1.CCK-8檢測細胞活力:選取白藜蘆醇5μM、10μM、20μM、40μM為干預濃度，24小時或48小時后，加入CCK-8試劑，37℃孵育2小時，在酶標儀中492nm處讀取96孔板吸光值。
　　2.流式細胞術:對BV-2細胞進行不同的干預之后，加入熒光標記的Aβ孵育2小時，流式細胞儀檢測細胞熒光強度來測定BV-2細胞對于Aβ的吞噬作用。
　　3.分子生物學實驗:對BV-2細胞

3、進行不同的干預之后，采用Western blot檢測BV-2細胞Trem2總蛋白表達及上清中sTrem2的分泌量，采用Real-time PCR檢測細胞IL-1β、TNF-α的mRNA轉錄水平。
　　二、PS1對BV-2細胞吞噬作用的調控及其機制研究
　　1.分子生物學實驗:用免疫共沉淀方法檢測PS1與Trem2的蛋白間相互作用，以細胞膜表面生物素化的方法檢測過表達PS1對BV-2細胞內Trem2蛋白轉運的影響。
　　

4、2.載體病毒感染:采用病毒感染的方法對構建BV-2細胞的穩(wěn)定轉染細胞系。
　　3.流式細胞術:采用流式細胞術檢測PS1過表達對于BV-2細胞Aβ吞噬作用的影響。
　　結果:
　　一、白藜蘆醇對BV-2細胞吞噬作用的調控及其機制研究
　　1在干預24小時的條件下，5μM、10μM、20μM濃度組白藜蘆醇與各自的空白對照組比較，對于BV-2細胞活力的影響均無明顯的差異，40μ M濃度組可降低BV-2細胞的活力。而在干

5、預48小時的條件下，5μ M、10μM濃度組對于BV-2細胞的活力仍然沒有影響，20μM、40μM濃度組可降低BV-2細胞的活力。
　　2.5μM的白藜蘆醇對于BV-2細胞的吞噬作用略有促進，但相比于對照組，差異不具有統(tǒng)計學意義;10μM、20μM濃度組相對于對照組顯著促進吞噬作用，并且相比于對照組具有統(tǒng)計學差異。
　　3.白藜蘆醇10μM劑量組BV-2細胞的Trem2蛋白表達量略有升高，但與對照組比較尚不具有統(tǒng)計學差異;2

6、0μ M劑量組可明顯升高Trem2蛋白表達量，相對對照組表達量約為后者的1.7倍，且差異具有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　4.白藜蘆醇10μM劑量組可一定程度上抑制小膠質細胞sTrem2的分泌，但與對照組比較，差異尚不具有統(tǒng)計學意義;20μM劑量組可明顯抑制sTrem2的分泌，相對對照組的分泌量為后者的70％左右，且差異具有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　5.Trem2-Fc4nM、20nM劑量組與相應濃度Fc對照組比較，BV-2細胞對A

7、β的吞噬作用略有降低，但無統(tǒng)計性差異;而40nM劑量組與相應濃度對照組比較，BV-2細胞對Aβ的吞噬作用明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學意義。
　　6.不同劑量的白藜蘆醇干預炎癥反應模型BV-2細胞后，白藜蘆醇各個劑量組均可降低細胞IL-1β的mRNA水平，且差異均具有統(tǒng)計學意義。白藜蘆醇對TNF-α的mRNA轉錄具有一定的下調作用，但是各劑量組相對對照組差異不具有統(tǒng)計學意義。
　　二、PS1對BV-2細胞吞噬作用的調控及其機制研

8、究
　　1.Trem2可以共沉淀PS1全長蛋白、PS1-NTF和PS1-CTF，而IgG對照組并沒有檢測到相應蛋白條帶。反向的驗證也證明，PS1-NTF抗體與PS1-CTF抗體的免疫沉淀物中，均可檢測到Trem2的表達，而IgG對照組并沒有出現(xiàn)相應的蛋白條帶。
　　2.BV-2-Vector組與BV-2-PS1組Trem2的蛋白總表達量基本一致，不存在差異性。細胞膜Trem2與總Trem2比值的結果分析表明，BV-2-PS1

9、組比值相對BV-2-Vector組明顯下降，且該差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.BV-2-PS1細胞系對于FAM-Aβ的吞噬明顯低于BV-2-Vector細胞系，且差異具有統(tǒng)計學意義。BV-2-PS1-Trem2細胞系相比BV-2-PS1細胞系對于FAM-Aβ的吞噬明顯增加，且差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　一、白藜蘆醇對BV-2細胞吞噬作用的調控及其機制研究
　　1.白藜蘆醇干預可以促進BV-2細胞的吞噬功

10、能，并且該促進作用存在劑量依賴性。
　　2.白藜蘆醇可上調細胞Trem2總蛋白的表達，下調sTrem2的分泌。
　　3.白藜蘆醇調節(jié)BV-2細胞吞噬功能的可能機制為上調細胞Trem2的表達和下調sTrem2的分泌。
　　4.白藜蘆醇可顯著降低Aβ誘導的BV-2細胞IL-1β的分泌，對TNF-α的分泌也有一定的下調作用，但結果無統(tǒng)計學意義，需要進一步探討。
　　二、PS1對BV-2細胞吞噬作用的調控及其機制研究