1、目的:視神經(jīng)損傷是臨床治療的難點(diǎn)，探討其損傷后修復(fù)相關(guān)問題對于視功能恢復(fù)和中樞神經(jīng)疾病的治療都有非常重要的意義。以往研究聚焦于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突再生，并以此來提高損傷修復(fù)，但未取得滿意結(jié)果。近年來研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)軸突生長的同時，出現(xiàn)了再生纖維投射紊亂，妨礙視覺功能恢復(fù)的新問題。有研究認(rèn)為神經(jīng)元極性紊亂在其中起到了重要作用，因為神經(jīng)元極性決定了突觸生長方向。而RGCs

2、突觸生長方向?qū)ζ鋼p傷修復(fù)過程中指導(dǎo)再生纖維投射有重要意義，因此恢復(fù)RGCs極性將是促進(jìn)視神經(jīng)修復(fù)的新途徑。
　　miRNA是調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育的重要因素之一，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，可能參與控制神經(jīng)元極性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-30b在視神經(jīng)損傷早期表達(dá)迅速升高，在原代培養(yǎng)RGCs中促進(jìn)其軸突生長，但具體作用機(jī)制還不清楚。Sema3A具有指導(dǎo)神經(jīng)元突起生長的作用，且最近研究發(fā)現(xiàn)Sema3A參與調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元極性，并且通過影響神經(jīng)元內(nèi)

3、cGMP/cAMP含量決定神經(jīng)突起成為軸突或者樹突，這提示Sema3A可以調(diào)節(jié)RGCs極性。而且我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-30b對Sema3A表達(dá)具有抑制效應(yīng)。因此我們推測miR-30b通過抑制Sema3A調(diào)節(jié)RGCs極性。
　　此外，視神經(jīng)損傷后繼發(fā)性缺血缺氧是造成RGCs不可逆損失、影響再生修復(fù)的重要因素之一，目前認(rèn)為氧剝奪損傷機(jī)制在其中發(fā)揮重要作用。近年的研究表明，MicroRNAs(miRNAs)參與機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，包括機(jī)

4、體組織對缺氧的應(yīng)答反應(yīng)。尤其miR-30b可以幫助視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷。那么miR-30b是否對糖氧剝奪導(dǎo)致的RGCs損傷發(fā)揮保護(hù)作用呢？尚需要進(jìn)一步實驗驗證。
　　本研究擬通過重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)RGCs調(diào)節(jié)miR-30b含量，明確miR-30b通過抑制Sema3A表達(dá)影響RGCs極性;其次，明確miR-30b在糖氧剝奪損傷中對RGCs的保護(hù)作用。為miR-30b在中樞神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用提供了新的思路和理論

5、依據(jù)。
　　方法:1、利用體外培養(yǎng)的原代RGCs，分別轉(zhuǎn)染rAAV-miR-30b mimic、rAAV-miR-30binhibitor和rAAV-miR nc，培養(yǎng)7d后免疫組化雙熒光染色標(biāo)記(Tubulin-Ⅲ/MAP2)區(qū)分RGCs軸突和樹突。熒光顯微鏡拍照記錄，利用IPP圖像分析軟件計數(shù)軸突/樹突長度，結(jié)合統(tǒng)計軟件分析miR-30b對RGCs極性的影響。
　　2、利用體外培養(yǎng)的原代RGCs，分別轉(zhuǎn)染rAAV-miR

6、-30b mimic、rAAV-miR-30binhibitor、rAAV-miR nc，以及結(jié)合應(yīng)用SiRNA-Sema3A及Sema3A高濃度組，檢測Sema3A下游信號因子。
　　3、將原代培養(yǎng)的細(xì)胞采用rAAV-miR nc、rAAV-miR-30b mimic和rAAV-miR-30binhibitor處理，培養(yǎng)細(xì)胞6d。各組細(xì)胞分別進(jìn)行低氧培養(yǎng)箱(37℃，體積分?jǐn)?shù)5％CO2、17％N2、3％O2)聯(lián)合低糖（糖濃度為1.

7、0g/L）培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)以建立原代糖氧剝奪RGCs模型，并與正常培養(yǎng)(37℃、5％CO2)的細(xì)胞進(jìn)行對照。采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測各組細(xì)胞活力，采用免疫熒光染色法檢測各組細(xì)胞中神經(jīng)元特異性標(biāo)志物TubulinⅢ的表達(dá)，并計算存活RGCs數(shù)目。采用Hoechst/PI染色法檢測各組細(xì)胞的凋亡和壞死情況。
　　結(jié)果:1、上調(diào)miR-30b可顯著增加原代培養(yǎng)RGCs軸突長度，顯著減少樹突個數(shù);從而提高RGCs雙極性率。

8、反之下調(diào)miR-30b對RGCs軸突長度沒有顯著影響，樹突個數(shù)沒有顯著改變。
　　2、在原代培養(yǎng)RGCs中，上調(diào)miR-30b可顯著降低Sema3A蛋白表達(dá)。而干擾Sema3A表達(dá)后，Sema3A含量也顯著降低。反而下調(diào)miR-30b表達(dá)量對Sema3A沒有影響。上調(diào)miR-30b可顯著增加PKA活性，降低CRMP-2(T514)含量;同時在原提高Sema3A濃度可顯著降低PKA活性，增加CRMP-2(T514)含量。
　　

9、3、在經(jīng)過糖氧剝奪處理后的原代培養(yǎng)RGCs中，上調(diào)miR-30b含量可見TubulinⅢ陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)，以及細(xì)胞凋亡率和死亡率明顯降低。但下調(diào)miR-30b含量對TubulinⅢ陽性細(xì)胞數(shù)量沒有明顯改變。
　　結(jié)論:在體外培養(yǎng)的原代RGCs中miR-30b水平升高，可以促進(jìn)軸突生長，抑制樹突生長，有助于維持RGCs雙極性特性。這一作用主要通過抑制Sema3A表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)PKA活性，降低CRMP-2磷酸化