1、1 研究目的: 激素引起的股骨頭壞死已為人們所熟知。隨著激素的廣泛應用，其發(fā)病率呈逐年增加趨勢，已占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位。因此，對 SANFH 的發(fā)病機理及治療方法機理的研究很有必要。 SANFH的確切的發(fā)病機理目前尚不清楚，普遍接受的觀點有如下學說：脂肪栓塞學說、骨細胞脂肪變性學說、骨內高壓及靜脈淤滯學說、微血管帶損傷和骨質疏松等學說。這些學說都不足以說明其發(fā)病機制。目前在蛋白分子水平的研究尚未見報道。 蛋

2、白質組學是后基因組時代的一門新興學科。差異蛋白質研究的重心在于尋找某種特定因素引起的細胞或組織樣本之間的蛋白質組差異，揭示其在生理或病理過程中的變化，探察細胞或機體對環(huán)境刺激的反應及細胞調控的機制，同時對某些標志性蛋白進行定性和功能分析。一旦能夠獲得蛋白質組差異的足夠信息，從理論上來說就可以推斷造成這種變化的原因。本研究試圖從激素對成骨細胞的影響中找出差異蛋白，從而闡明SANFH的發(fā)病機理。這在理論上是一個突破，也為SANFH的治療提供

3、理論指導。 長期或大量使用糖皮質激素，血液受熱煎熬而粘滯，運行不暢，或灼傷脈絡血溢脈外留于股骨頭局部而成瘀痹，或熱舍于腎，內伐腎精，均可致骨缺血性壞死。大多數(shù)學者認為 SANFH 以“腎虛”、“血瘀”為主。因此，本研究根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”的理論，運用補腎的代表方六味地黃丸含藥血清對激素作用下成骨樣細胞的影響，從差異蛋白方面入手，闡明 SANFH 的發(fā)病機理和補腎法治療SANFH的機理。 2 研究方法: 2.1 實驗

4、研究 2.1.1 六味地黃丸含藥血清對OS-732細胞增殖和分化的影響 目的:觀察補腎中藥對成骨樣細胞增殖分化的影響。 方法:制備低、中、高劑量的六味地黃丸含藥血清。10％低、中、高劑量的六味地黃丸含藥血清培養(yǎng)OS-732 細胞，顯微鏡下觀察細胞生長情況；細胞計數(shù)和繪制生長曲線；MTT 法檢測細胞增殖；進行細胞堿性磷酸酶 (ALP)活性測定。 結果:含藥血清組細胞生長良好，中劑量組與對照組相比P<0.05

5、，統(tǒng)計學有明顯差異；在細胞增殖和細胞堿性磷酸酶(ALP)活性測定方面，中劑量組與對照組相比P<0.05，統(tǒng)計學有明顯差異。 結論:合適劑量的補腎中藥對成骨樣細胞的增殖和分化有明顯的促進作用。 2.1.2不同濃度DMX對OS-732細胞凋亡和細胞周期的影響 目的:通過不同濃度DMX體外培養(yǎng)，分析糖皮質激素對成骨樣細胞凋亡和周期的影響。 方法:加入低、中、高濃度DMX培養(yǎng)OS-732細胞，于24th 和 48

6、h 兩個時間點進行流式細胞儀 (FCM)檢測細胞凋亡，分析細胞周期。 結果:24h 低濃度DMX導致細胞G<,2>+M期明顯增加，與對照組相比 P<0.05，有統(tǒng)計學差異；中濃度在各期與對照組無明顯差異；高濃度DMX對G0/G1期有阻滯作用，與對照組相比P<0.05，有統(tǒng)計學差異。對照組和DMX組均出現(xiàn)了凋亡峰，低濃度和中濃度DMX 與對照組相比，細胞凋亡率無明顯差異；而高濃度組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。48h對

7、細胞凋亡和細胞周期無明顯變化。 結論:糖皮質激素使用的時間和量對成骨樣細胞的作用明顯不同，說明小劑量糖皮質激素(生理需要量)對成骨樣細胞的增殖有促進作用，高劑量糖皮質激素 (超過生理需要量)對成骨樣細胞的增殖和分化有抑制作用。 2.1.3 補腎法對激素干預成骨樣細胞作用的電鏡觀察 目的:觀察激素組和中藥治療組與對照組相比較，成骨樣細胞形態(tài)上的改變，了解其組織學上的差異。 方法:對照組、激素造模組和中藥治療

8、組培養(yǎng)OS-732細胞，收集細胞后固定、染色，電鏡下觀察細胞形態(tài)。 結果:激素組細胞形態(tài)發(fā)生變化，形態(tài)不規(guī)則，線粒體減少，空泡增多；中藥治療組細胞形態(tài)明顯改善，線粒體及內質網明顯增多。 結論:糖皮質激素作用可以使成骨樣細胞結構發(fā)生改變，從而影響細胞的成骨功能；補腎中藥可以改善成骨樣細胞的形態(tài)，從而減少成骨樣細胞凋亡。 2.1.4 補腎法對激素干預成骨樣細胞作用的差異蛋白初步分析 目的:比較激素組和中藥治療

9、組與對照組雙向電泳圖譜上蛋白點的差異，分析激素引起成骨樣細胞凋亡的蛋白表達和補腎中藥對凋亡細胞作用的蛋白表達變化。 方法:提取對照組、激素模型組和中藥治療組培養(yǎng)OS-732 細胞的總蛋白，雙向電泳，對差異蛋白點進行分析。 結果:激素組有7個蛋白表達下降，其中，SSP1005、SSP2301、SSP3202和SSP6501四個點最為明顯，SSP5604 點蛋白不發(fā)生表達；中藥治療組對上述7個點的表達均有不同程度的增強，SS

10、P5604 點明顯增強。 結論:糖皮質激素作用可以使成骨樣細胞某些蛋白表達減弱，從而造成成骨樣細胞凋亡；補腎中藥可以使某些蛋白表達明顯增強。 綜上所述，補腎中藥可以促進成骨樣細胞的增殖和分化，改善成骨樣細胞的形態(tài)結構；抑制糖皮質激素引起的成骨樣細胞凋亡，增強因糖皮質激素引起的成骨樣細胞凋亡所致的某些蛋白的表達。 2.2 臨床研究 目的:觀察補腎中藥治療SANFH 的臨床療效。 方法:66例病人分為

11、兩組，對照組給予生脈成骨片，合并用藥組給予生脈成骨片加六味地黃丸。從疼痛、功能、關節(jié)活動度及X線評價四個方面對兩組進行觀察比較。 結果:兩組治療前后總的療效均有顯著性差異。但合并用藥組在緩解疼痛、改善關節(jié)活動度和關節(jié)功能方面明顯優(yōu)于對照組，而在X線評價無明顯差異。 結論:補腎法是治療SANFH 兩大治法之一，在活血通絡的同時，加用補腎中藥療效更佳，特別在緩解疼痛、改善關節(jié)活動度和關節(jié)功能方面有一定的優(yōu)勢。 2.3