1、免疫分析是利用抗原與抗體之間的高特異性反應實現對抗體、抗原或相關物質進行檢測的分析方法。免疫分析是一種非常重要的生物分析方法,它被廣泛地應用于臨床診斷、食品和環(huán)境分析、生物及醫(yī)學研究等領域。目前免疫分析主要以微孔板為實驗平臺的異相分析模式。這種方法需要抗體的包埋,緩慢的異相免疫反應,多次耗時的沖洗,酶放大反應和離線檢測分析等步驟。因此,這種方法操作繁瑣、分析時間長、不能滿足某些快速檢測和診斷的要求。均相免疫分析不需要分離,能夠直接測定免

2、疫反應混合體系中的待測物(抗體或者抗原)。這種方法通常快速,而且很容易實現微型化和自動化。目前某些檢測方法如熒光偏振、熒光共振能量轉移、生物發(fā)光能量轉移被用于均相免疫分析。然而,由于這些檢測方法的靈敏度較低,不能滿足臨床檢測的要求。
　　 本論文旨在基于單分子和單顆粒技術,發(fā)展高靈敏的均相免疫新方法,用于腫瘤標志物的分析。主要研究工作包括如下幾個方面:
　　 1)基于熒光自相關光譜和互相關光譜,發(fā)展了均相免疫分析方法。為

3、了克服熒光相關光譜在研究分子間相互作用時,需要分子量相差4倍的限制,本文構思了兩個策略,即采用熒光交叉相關光譜系統(tǒng)和減小抗原分子的分子量。首先,我們構建了一種新型的單激光激發(fā)的熒光交叉相關光譜系統(tǒng)。采用量子點這種新型的熒光納米材料為探針,以人IgG和羊抗人IgG的免疫反應為研究模型,構建了均相免疫分析檢測系統(tǒng)。基于該系統(tǒng)我們測定了免疫復合物的濃度及其特征擴散時間與動力學半徑。實驗結果表明單激光激發(fā)的熒光交叉相關光譜系統(tǒng)克服了現有的熒光交

4、叉相關光譜的儀器結構復雜和操作繁瑣的缺點,成功地消除了Cross-talk效應。然后,我們以人工合成的多肽為免疫抗原,基于熒光自相關光譜方法,建立了一種均相競爭免疫分析方法。由于多肽抗原具有和生物抗原一樣的生理活性,而且容易制備,使它成為一種理想的抗原。其主要優(yōu)點是分子量小,能滿足熒光自相關光譜對分子量的要求。我們利用這個策略系統(tǒng)地研究了腫瘤標志物CA125抗原與其抗體的免疫反應,對該競爭免疫反應的靈敏度、特異性、可逆性、解離常數、解離

5、速率等進行了研究。研究結果表明該方法靈敏度約為0.1 nM,可以用于某些較高含量的組分測定。
　　 2)基于金納米粒子(Gold Nanoparticles,GNPs)在溶液中的布朗運動和共振散射效應,我們提出了一種高靈敏的單個金納米粒子檢測新方法,稱之為單個金納米粒子計數法(Single Gold Nanoparticles Counter,SGNPC)。它的工作原理是在高聚焦的激光束中,GNPs由于布朗運動和共振散射效應在檢

6、測的微區(qū)內(小于1 fL檢測體積)產生強的光子爆發(fā)。實驗表明光子爆發(fā)數與GNPs濃度之間存在非常好的線性關系(R=0.992)。本文系統(tǒng)地研究了某些因素對單個GNPs信號的影響,發(fā)現GNPs的光子爆發(fā)強度隨其粒徑和激發(fā)光強度增大而顯著增強。我們考察了合并時間(Bin-time)和測定時間對檢測靈敏度的影響。在優(yōu)化的條件下,對36nmGNPs的檢測限為17 fM,線性范圍為17 fM到170 pM。該方法具有很好的重現性,光子爆發(fā)數計數的

7、日內和日間重現性(相對標準偏差,RSDs)分別為4.1％(n=11)和3.6％(n=7)。進而,我們將SGNPC方法成功地與微流控芯片聯用。研究了在一定流速下,GNPs光子爆發(fā)數與其濃度和流速的關系。實驗結果表明在一定的壓力場下,GNPs的光子爆發(fā)數與其濃度同樣具有很好的線性關系。同時,在相同濃度下,GNPs溶液的流速越大則爆發(fā)數越多,其檢出限越低。我們相信SGNPC方法以及SGNPC與微流控芯片聯用系統(tǒng)在均相生物分析領域中具有重要的應

8、用前景。
　　 3)基于SGNPC方法和GNPs標記技術,發(fā)展一種高靈敏的均相免疫分析新方法。在均相免疫分析中采用夾心免疫模式,分別將兩種抗體修飾在GNPs探針上。當這兩種抗體-GNPs探針加入含有目標物(抗原)的樣品中,它們將與目標物的結合,會導致GNPs形成二聚物(或者低聚體)。隨著目標物增加,溶液中的GNPs數目會隨之減少。SGNPC可根據光子爆發(fā)數的改變來檢測GNPs數目上的變化。基于這種單顆粒技術建立了腫瘤標志物如癌胚

9、抗原(CEA)和α-胎蛋白(AFP)的均相免疫分析方法。在優(yōu)化的條件下,CEA和AFP的檢測限分別為130 fM和714 fM,該方法比現行的均相免疫分析方法的檢測限低2個數量級。該方法成功地用于健康個體與癌癥患者血清中CEA和AFP濃度的測定。測定的結果與ELISA分析結果基本一致。與現行的方法相比,我們方法具有靈敏度高、操作簡便、分析時間短等特點。原理上我們的方法適用于各種臨床免疫分析和藥學上的生物分子識別反應的監(jiān)測。更重要的是,該

10、方法的檢測體積少于1 fL,樣品的用量可以縮減到nL水平,可能成為均相免疫分析中高通量檢測平臺。
　　 4)GNPs具有非常強的光吸收和散射性質,被成功地應用于生物標記、基因載體和光熱治療等領域。GNPs的粒徑對其光學和化學性質有至關重要的影響。然而,在GNPs的生物應用中,我們缺乏一種有效的方法對溶液中GNPs(及其連接物)的粒徑和粒徑分布進行表征。因此我們提出了一種共振散射相關光譜技術(Resonance Light Sca

11、ttering CorrelationSpectroscopy,RLSCS)表征GNPs粒徑分布的新方法。該方法基于共振散射相關光譜技術,將遺傳算法(GA)用于散射相關函數曲線解析,從而獲得GNPs的粒徑和粒徑分布。我們首先參照熒光相關光譜的理論,提出了散射相關光譜技術表征GNPs粒徑分布模型,然后用計算機進行模擬。在模擬中,首先預設了各種粒徑分布模式,通過計算求得其對應的相關曲線,用Matlab程序實現了遺傳算法。結果表明遺傳算法.共