1、分類號：密級：UDC：學號：T104112015021033南昌大學同等學力申請碩士學位研究生學位論文Ikaros不同可變剪切體對細胞增殖和凋亡的影響不同可變剪切體對細胞增殖和凋亡的影響EffectsofdifferentIkarosisofmsoncellproliferationapoptosis易麗君培養(yǎng)單位（院、系）：南昌大學基礎醫(yī)學院指導教師姓名、職稱：曾小平副教授申請學位的學科門類：醫(yī)學學科專業(yè)名稱：免疫學論文答辯日期：20

2、18年5月31日答辯委員會主席：評閱人：年月日摘要摘要目的目的通過分析兒童急性淋巴細胞白血病臨床骨髓樣本中Ikaros的不同表現(xiàn)亞型，初步探討Ikaros缺失性突變(功能缺失)對細胞生物學行為的影響以及引起多藥耐藥的可能分子機制，為兒童ALL的個性化治療靶點提供理論依據(jù)。方法方法(1)收集110例2013年2015年在江西省兒童醫(yī)院確診的兒童急性淋巴細胞白血病患兒的骨髓樣本，所收集的樣本均獲得患兒家屬及醫(yī)院倫理委員會的同意。(2)利用淋

3、巴細胞分離液分離單個核細胞，提取總RNA，測定RNA的濃度和純度，逆轉錄成cDNA，巢式PCR及克隆測序分析確定患兒Ikaros的表達亞型，分析Ikaros表達亞型與臨床其它實驗指標的相關性，并且統(tǒng)計Ikaros異常表型與預后的相關性。(3)以IK1作為Ikaros功能型代表，以IK6為Ikaros無功能型代表，通過構建Ikaros功能型型和無功能型表達載體，在人胚腎293T細胞株中，按照轉染試劑Lip2000說明書的操作流程，將pcD

4、NA3.1vect、pcDNA3.1IK1、pcDNA3.1IK6分別轉染細胞，48小時后收集細胞進行下游實驗。細胞提取總蛋白，免疫蛋白印跡法(westernblotWB)檢測IK1和IK6，MTT法檢測細胞的增殖率，WB檢測細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl2的表達水平，化學發(fā)光法檢測細胞凋亡相關因子caspase3水平，通過各項檢測指標，說明IK1和IK6對293T細胞增殖和凋亡生物學行為的影響。同時通過qPCR熒光定量檢測細胞細胞凋亡

5、相關基因(BCL2、BAX)的表達水平，比較缺失突變型Ikaros對細胞的影響。分析Ikaros功能狀態(tài)影響PI3KAKT信號通路的分子機制及參與細胞凋亡的分子機制。經pubmed序列比對，設計引入酶切位點（BamHI和XhoI）的Ikaros引物，PCR擴增，經膠回收后與表達載體pcDNA3.1表達載體同時進行雙酶切，利用T4連接酶連接，對可疑陽性重組子的基因序列測序鑒定。(4)慢病毒包裝GV3583FLAGEGFPPUROIK6(L