1、背景與目的：
　　 β-珠蛋白生成障礙性貧血(β-thalassemia，β-地貧)是常見(jiàn)的單基因遺傳病，是世界上發(fā)病率最高的遺傳性疾病之一。它的病理生理基礎(chǔ)是β-珠蛋白基因的突變或缺失，造成相對(duì)過(guò)剩的α-珠蛋白鏈聚合形成包涵體，使紅細(xì)胞生成減少、破壞過(guò)多而造成貧血。人類珠蛋白基因在個(gè)體發(fā)育的不同時(shí)間表現(xiàn)為階段特異性的表達(dá)與關(guān)閉，α-珠蛋白基因簇表現(xiàn)為ξ→α基因的轉(zhuǎn)換，而β-珠蛋白基因簇表現(xiàn)為ε→γ和γ→β基因的轉(zhuǎn)換。自上世紀(jì)8

2、0年代開(kāi)始的藥物基因調(diào)控治療，目前已進(jìn)入了臨床研究階段，并取得了較好的療效。γ-珠蛋白基因誘導(dǎo)劑的作用機(jī)制，是利用重新激活已近乎關(guān)閉的γ-珠蛋白基因表達(dá)，以改善α-和非α-珠蛋白鏈之間的不平衡，合成胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin，HbF)以彌補(bǔ)成人血紅蛋白(adult hemoglobin，HbA)的不足，最終達(dá)到減少溶血、緩解貧血癥狀的目的。由于此類藥物療效顯著，所以在這一研究方向上的探索具有特別重要的意義。
　

3、　 目前研究的γ-珠蛋白基因誘導(dǎo)劑主要有：羥基脲(hydroxyurea，HU)、5-氮胞核苷(5-azaeytidine，5-AZAC)、丁酸鹽類及其衍生物等。由于這些藥物存在骨髓抑制、潛在的致癌性、半衰期較短和價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，所以在臨床上的應(yīng)用受到限制。因此，迫切需要發(fā)掘一些新的高效、低毒、價(jià)廉的γ-珠蛋白基因激活藥物以改善治療現(xiàn)狀。與西藥研制相比，中藥研發(fā)周期短，可解決西藥化合物人工合成難的問(wèn)題，且療效和毒副作用較明確，具有良好

4、的研發(fā)前景。國(guó)內(nèi)已有報(bào)道如益髓生血顆粒、黃根加味湯等中藥方劑可重新激活γ-珠蛋白基因表達(dá)。但由于地貧基因表型多樣，加上中藥方劑成分較多，有效部分難以評(píng)估，所以目前許多學(xué)者致力于篩選出單味中藥及其活性成分，如從一些抗腫瘤中藥中篩選出了甲異靛、三尖杉酯堿等成分，旨在評(píng)估其治療效果及作用機(jī)制。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中從益氣補(bǔ)血、補(bǔ)腎升髓等中藥中篩選出了單味中藥黃芪，發(fā)現(xiàn)它可有效誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化，并上調(diào)γ-珠蛋白基因表達(dá)。
　　

5、因西藥類γ-珠蛋白基因誘導(dǎo)劑的不良反應(yīng)均存在不同程度的劑量依賴性，所以低劑量聯(lián)合用藥是一種值得研究的治療途徑，期望在減少藥物劑量的同時(shí)，又能利用各藥物作用靶點(diǎn)或機(jī)制的互補(bǔ)，使γ-珠蛋白基因表達(dá)增高。國(guó)外一些學(xué)者已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床研究中嘗試將丁酸鹽類與促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)或5-AZAC合用等，旨在探索不同的聯(lián)合用藥方式，發(fā)現(xiàn)某些藥物聯(lián)合應(yīng)用可比單獨(dú)用藥更能顯著提高γ-珠蛋白基因表達(dá)的水平。但也有觀點(diǎn)認(rèn)為，

6、某些聯(lián)合用藥反而增加細(xì)胞毒性，且對(duì)HbF合成的調(diào)節(jié)作用的結(jié)論尚不一致，有待進(jìn)一步研究。
　　 西藥起效時(shí)間快，但作用時(shí)間不能持久且不良反應(yīng)較大；中藥起效雖慢，但藥效維持時(shí)間較長(zhǎng)且毒副作用較小。本課題組進(jìn)一步研究證明：黃芪中起誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)作用的有效成分主要是黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)，它不僅可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化，而且可增加γ-珠蛋白基因表達(dá)和HbF合成。與西藥丁酸鈉(

7、sodium butyrate，NaB)相比，它無(wú)明顯細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，且誘導(dǎo)持續(xù)的時(shí)間較長(zhǎng)。已知APS具有廣泛的藥理作用，是很有價(jià)值的免疫增強(qiáng)劑，對(duì)靶器官有明顯的保護(hù)作用，可減輕放、化療后的骨髓抑制等不良反應(yīng)。且其他研究也發(fā)現(xiàn)，APS有刺激骨髓造血、增強(qiáng)免疫功能及抗腫瘤的作用，對(duì)骨髓細(xì)胞有保護(hù)作用。能否將中西藥聯(lián)合應(yīng)用，達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、減少劑量的效果，值得進(jìn)一步探討。
　　 近年來(lái)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較廣泛的紅系細(xì)胞體外液體培養(yǎng)法是二步液

8、體培養(yǎng)法，用此方法建立的紅系細(xì)胞模型比K562細(xì)胞更能模擬人體內(nèi)紅細(xì)胞的生成過(guò)程，體現(xiàn)個(gè)體發(fā)育中珠蛋白基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換。
　　 本研究旨在探討APS和NaB單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)人紅系細(xì)胞增殖和珠蛋白基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)選用臍血來(lái)提取體外培養(yǎng)所需的造血干/祖細(xì)胞，并建立紅系細(xì)胞二步液體培養(yǎng)法。以使用該液體方法培養(yǎng)的紅系細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察正常紅系細(xì)胞珠蛋白基因的表達(dá)規(guī)律，再進(jìn)一步探討單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)珠蛋白基因表達(dá)的影響。并采用臺(tái)盼藍(lán)拒染

9、活細(xì)胞計(jì)數(shù)、形態(tài)學(xué)觀察和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)等方法對(duì)培養(yǎng)的紅系細(xì)胞進(jìn)行觀察和分析，探討單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)和各珠蛋白基因mRNA的表達(dá)等方面的影響，而此研究結(jié)果將會(huì)為臨床聯(lián)合用藥新方案的設(shè)計(jì)和實(shí)施提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1臍血來(lái)源：
　　 標(biāo)本來(lái)自于廣州市南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院產(chǎn)

10、科健康產(chǎn)婦分娩胎兒臍帶，排除傳染性疾病、血液疾病、惡性腫瘤、各種嚴(yán)重妊娠并發(fā)癥等病例，用無(wú)菌采血袋(PCD-A抗凝)密閉式方法保存。
　　 2實(shí)驗(yàn)分組：
　　 實(shí)驗(yàn)分為6組，APS+NaB(2.5 mg/mL+250μmol/L)為低劑量聯(lián)藥組，APS2.5 mg/mL、NaB250μmol/L為低劑量單藥組，APS5.0mg/mL、NaB500μmol/L為常規(guī)劑量單藥組，空白對(duì)照組為未加藥組。
　　 3人紅系

11、細(xì)胞二步液體培養(yǎng)：
　　 從臍血中分離單個(gè)核細(xì)胞，分兩步在兩種不同的培養(yǎng)體系中進(jìn)行人紅系細(xì)胞的體外液體培養(yǎng)。在研究正常紅系細(xì)胞在此液體培養(yǎng)過(guò)程中珠蛋白基因的表達(dá)規(guī)律時(shí)，分別在第二階段的第0、2、4、6、8、10、12和14天采樣；在研究單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)紅系細(xì)胞增殖和珠蛋白基因表達(dá)的作用時(shí)，在第二階段的第6天按所需終濃度加藥，然后分別在第8、10、12和14天采樣。
　　 4臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察人紅系細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中

12、不同時(shí)間點(diǎn)的增殖情況及藥物對(duì)細(xì)胞抑制率的影響。
　　 5 RT-PCR技術(shù)分析人紅系細(xì)胞7種珠蛋白基因(ξ，α，Gγ，Aγ，δ和β)在培養(yǎng)過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。將各組與內(nèi)參照表達(dá)量的值比較，得出相對(duì)光密度值；并以空白對(duì)照組表達(dá)量為1，計(jì)算其他組的表達(dá)倍數(shù)。
　　 6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，不同時(shí)間點(diǎn)多組間的比較及固定濃度效應(yīng)作時(shí)間因素

13、的單獨(dú)效應(yīng)分析采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，固定時(shí)間效應(yīng)作濃度因素的單獨(dú)效應(yīng)分析采用單向方差分析(One-Way ANOVA)，基于方差分析的多重比較如方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1體外液體培養(yǎng)人紅系細(xì)胞的增殖及珠蛋白基因表達(dá)的變化1.1細(xì)胞計(jì)數(shù)變化紅系細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖水平不同(F=655.682，P<0.001)。從第6天開(kāi)始

14、細(xì)胞數(shù)呈指數(shù)上升，第10天后增殖速度逐漸減慢進(jìn)入平臺(tái)期，至第12天達(dá)高峰(4.01±0.25)×106/ml(約為初始細(xì)胞數(shù)的4倍)。
　　 1.2各珠蛋白基因表達(dá)的變化α-珠蛋白基因簇：隨著紅系細(xì)胞的分化和成熟，α-mRNA的表達(dá)升高(F=19.845，P=0.046)，第14天達(dá)峰值0.96±0.12；ξ-mRNA只有少量表達(dá)，但不隨紅系細(xì)胞的成熟發(fā)生變化。
　　 β-珠蛋白基因簇：隨著紅系細(xì)胞的分化和成熟，β-mR

15、NA的表達(dá)升高(F=28.936，P=0.028)，第14天達(dá)峰值0.96±0.20；Gγ-和Aγ-mRNA的表達(dá)下降(F=48.923，P=0.016；F=19.353，P=0.042)，第14天分別達(dá)最低值0.45±0.05和0.37±0.08；ε-和δ-mRNA有少量表達(dá)，但不隨紅系細(xì)胞的成熟發(fā)生變化；γ-和β-mRNA表達(dá)的交叉轉(zhuǎn)換在第8～9天。
　　 2 APS和NaB單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)人紅系細(xì)胞增殖和珠蛋白基因表達(dá)的作

16、用2.1 APS和NaB單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)紅系細(xì)胞增殖的影響用藥后，各組的紅系細(xì)胞從第8天開(kāi)始增殖減弱，第10天后逐漸達(dá)到一個(gè)穩(wěn)態(tài)，第12天APS+NaB聯(lián)藥組的細(xì)胞數(shù)(3.13±0.24)(×106/mL)大于NaB常規(guī)劑量組(2.88±0.19)(×106/mL)，小于APS常規(guī)劑量組(3.52±0.36)(×106/mL)。
　　 APS和NaB單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)紅系細(xì)胞均存在不同程度的抑制作用(F=18.616，P=0.00

17、0)。隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，APS+NaB聯(lián)藥組抑制率的峰值(36.84±1.27)％小于NaB常規(guī)劑量組(44.55±2.83)％，大于APS常規(guī)劑量組(19.00±7.76)％(P<0.05)。
　　 2.2 APS和NaB單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)紅系細(xì)胞珠蛋白基因表達(dá)的影響APS+NaB低劑量聯(lián)合用藥后Gγ-mRNA水平上調(diào)的峰值為2.65±0.13倍(F=23.850，P=0.000)；大于APS和NaB常規(guī)劑量組(1.86±

18、0.13和1.85±0.33倍)，差異有顯著性(P<0.05)；亦明顯大于APS和NaB低劑量組(1.23±0.09和1.38±0.22倍)，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 APS+NaB低劑量聯(lián)合用藥后Aγ-mRNA水平上調(diào)的峰值為1.53±0.23倍(F=53.714，P=0.015)；與APS和NaB常規(guī)劑量組(1.48±0.07和1.35±0.12倍)比，差異無(wú)顯著性(P>0.05)；明顯大于APS和NaB低劑量組

19、(1.14±0.21和1.15±0.18倍)，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 APS和NaB單獨(dú)或聯(lián)合用藥后的不同時(shí)間點(diǎn)，各組的β-、ε-、δ-、α-和ξ-珠蛋白基因表達(dá)水平與未用藥組相比差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1成功建立了人紅系細(xì)胞體外二步液體培養(yǎng)方法，證實(shí)了使用該方法體外培養(yǎng)的紅系細(xì)胞能較好地模擬它在人體內(nèi)的發(fā)育過(guò)程，為紅系細(xì)胞分化、成熟過(guò)程中珠蛋白基因表達(dá)轉(zhuǎn)換的研究提供了

20、良好模型。
　　 2首次在體外液體培養(yǎng)的人紅系細(xì)胞上證明，APS常規(guī)劑量單獨(dú)用藥可上調(diào)γ-珠蛋白基因的表達(dá)，尤其增加Gγ-mRNA的轉(zhuǎn)錄，且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用弱。對(duì)β-、ε-、和δ-珠蛋白基因等其他β-珠蛋白基因簇的表達(dá)無(wú)明顯影響，對(duì)α-和ξ-珠蛋白基因等α-珠蛋白基因簇的表達(dá)也無(wú)顯著作用。
　　 3首次在體外液體培養(yǎng)的人紅系細(xì)胞上證明，APS和NaB低劑量聯(lián)合用藥可上調(diào)γ-珠蛋白基因的表達(dá)，尤其增加Gγ-mRNA的轉(zhuǎn)

21、錄，且減輕了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。對(duì)β-、ε-、和δ-珠蛋白基因等其他β-珠蛋白基因簇的表達(dá)無(wú)明顯影響，對(duì)α-和ξ-珠蛋白基因等α-珠蛋白基因簇的表達(dá)也無(wú)顯著作用。
　　 4首次在體外液體培養(yǎng)的人紅系細(xì)胞上證明，APS和NaB低劑量聯(lián)合用藥比APS及NaB常規(guī)劑量單獨(dú)用藥，能更有效誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因的表達(dá)，且減輕細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及細(xì)胞毒性。
　　 5本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為誘導(dǎo)γ-珠蛋白基因表達(dá)的聯(lián)合用藥研究增加了新的科學(xué)依據(jù)及研究思路，為