1、巴氏桿菌病(Pasteurellosis)是由多殺性巴氏桿菌引起的一類傳染病的總稱，見于各種畜禽和人類。牛巴氏桿菌病潛伏期短，傳播速度快，死亡率高，常對(duì)畜牧業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，預(yù)防巴氏桿菌病主要用滅活疫苗或弱毒疫苗，這些疫苗起到了一定的積極作用。但是，巴氏桿菌血清型眾多，而傳統(tǒng)疫苗通常只對(duì)同型菌株有較好的保護(hù)作用，并且弱毒疫苗還可能造成安全隱患。因此，人們希望研究出一種能對(duì)異種血清型菌株提供保護(hù)且有安全保證的新型疫苗。本實(shí)驗(yàn)室有

2、相關(guān)研究表明，多殺性巴氏桿菌的plpE基因具有較高的保守性;并且，國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道，多殺性巴氏桿菌的PlpE蛋白很可能是一種交叉保護(hù)性抗原。因此，本研究針對(duì)牛源A型多殺性巴氏桿菌CQ2株plpE基因的克隆表達(dá)及DNA疫苗的研究進(jìn)行了以下工作:
　　 1、CQ2株plpE基因的克隆表達(dá)及其免疫學(xué)活性分析
　　 擴(kuò)增牛源A型多殺性巴氏桿菌CQ2株plpE基因（去除信號(hào)肽），將擴(kuò)增的DNA片段命名為e1。測(cè)序發(fā)現(xiàn)e1第385

3、～387位為TAA（終止密碼子），提示CQ2株plpE基因截段表達(dá)的可能。以385～387位TAA的存在將e1分為前半段384bp、后半段564bp。擴(kuò)增后半段基因并將其命名為e2，融合擴(kuò)增前后兩段基因并將其命名為e3。
　　 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)/e1、pET30a(+)/e2、 pET30a(+)/e3，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，分別表達(dá)約24kD、28kD、44kD蛋白，符合plpE基因截段表達(dá)時(shí)的推導(dǎo)

4、值。將三種蛋白依次命名為E1、E2、E3。經(jīng)Western-blot分析，蛋白E1、E3有免疫學(xué)活性，而蛋白E2不與用CQ2株攻毒獲得的牛陽性血清發(fā)生反應(yīng)。
　　 用蛋白E1、E3的抗血清分別與CQ2全菌蛋白、蛋白E1、E2、E3進(jìn)行Western-blot反應(yīng)，證實(shí)CQ2株plpE基因確為截段表達(dá)。
　　 對(duì)CQ2株和其他多殺性巴氏桿菌菌株的plpE基因進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)除了本實(shí)驗(yàn)室和CQ2株來自同一批病料的CQ1株

5、有截段終止密碼子，本實(shí)驗(yàn)室其他菌株和GenBank發(fā)表的所有多殺性巴氏桿菌都無此現(xiàn)象，說明CQ2株plpE基因的截段表達(dá)為特例，不具普適性。
　　 2、PlpE蛋白對(duì)小鼠的免疫原性
　　 用蛋白E1、E3免疫小鼠，連續(xù)免疫三次，三免后10d用ELISA法檢測(cè)抗體，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)免疫組的抗體水平都極顯著高于對(duì)照組，且兩個(gè)免疫組之間無顯著差異。用牛A型巴氏桿菌CQ2、CQ6、B型巴氏桿菌和禽A型巴氏桿菌進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明兩種蛋

6、白都不能保護(hù)小鼠抵抗禽巴氏桿菌的攻擊，但對(duì)其他三種菌都能提供一定保護(hù)，蛋白E1對(duì)CQ2、CQ6、B型巴氏桿菌的保護(hù)率依次為42.9％、57.1％、28.6％，蛋白E3依次為57.1％、71.4％、14.3％。
　　 3、DNA疫苗的研究
　　 以DNA片段e1、e3為外源基因，以真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)為載體，構(gòu)建DNA疫苗。用DNA疫苗pcDNA3.1(+)/e1、pcDNA3.1(+)/e3免疫小鼠，連續(xù)免

7、疫三次，三免后10d用ELISA法檢測(cè)抗體，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)免疫組的抗體水平都極顯著高于對(duì)照組，且pcDNA3.1(+)/e3免疫組抗體水平極顯著高于pcDNA3.1(+)/e1，但兩個(gè)DNA疫苗免疫組的抗體水平都極顯著低于兩個(gè)蛋白免疫組。用牛A型巴氏桿菌CQ2、CQ6、B型巴氏桿菌和禽A型巴氏桿菌進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明兩種DNA疫苗都不能保護(hù)小鼠抵抗牛B型巴氏桿菌和禽巴氏桿菌的攻擊，但能對(duì)牛A型巴氏桿菌CQ2和CQ6提供一定保護(hù)，pcDNA3

8、.1(+)/e1對(duì)CQ2、CQ6的保護(hù)率依次為28.6％、57.1％，pcDNA3.1(+)/e3依次為28.6％、42.9％。
　　 從小鼠生存曲線走勢(shì)來看，四種疫苗免疫組都比對(duì)照組下降更慢，說明四種疫苗對(duì)四種菌都有一定的保護(hù)作用，由強(qiáng)到弱依次為:蛋白E3＞蛋白E1＞pcDNA3.1(+)/e1＞pcDNA3.1(+)/e3，這與四種疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力基本一致，說明蛋白的保護(hù)力比DNA疫苗高，且完整蛋白的保護(hù)力比截段蛋