1、禽多殺性巴氏桿菌是引起食源性動物呼吸道感染的一種重要的病原菌，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，控制禽巴氏出血癥的疫苗主要有滅活疫苗和減毒活疫苗。但這些傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)效果并不理想。DNA疫苗制備方便、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可在動物體內(nèi)持續(xù)誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答。殼聚糖是一種生物可降解性的天然多糖，可保護(hù)DNA免受核酸酶的降解，在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有巨大的潛力。因此殼聚糖DNA納米疫苗成為當(dāng)前DNA疫苗的研究熱點。
　　本文以該基因為研究對象，

2、通過PCR擴增該基因，采用BamHⅠ、EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，并將其導(dǎo)入真核表達(dá)載體的多克隆位點，構(gòu)建并擴增該重組質(zhì)粒，與0.02％的殼聚糖溶液混合，通過復(fù)凝聚法制備殼聚糖-PtfA納米疫苗。采用凝膠阻滯試驗、透射電鏡觀察，確定最佳N/P比；將該疫苗免疫小鼠，間接 ELISA法檢測小鼠血清抗體水平、MTT法外周血淋巴細(xì)胞增殖率、試劑盒法測定IFN-γ分泌水平及該疫苗的免疫保護(hù)率。試驗結(jié)果表明，以 N/P比為2.5制備的殼聚糖-pcDNA3

3、.1(+)/PtfA納米顆粒，85%的顆粒呈規(guī)則的球狀，包封率高、大小均一，其粒徑在200nm左右；免疫后，殼聚糖-重組質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組小鼠血清抗體水平、淋巴細(xì)胞增殖率含量顯著高于生理鹽水組、空載體組及其殼聚糖復(fù)合物組（p<0.01），且殼聚糖-重組質(zhì)粒組略高于重組質(zhì)粒組；這兩組 IFN-γ含量分別達(dá)到了359.31ng/L、310.14ng/L，極顯著高于另外三組；攻毒后，殼聚糖-重組質(zhì)粒組的免疫保護(hù)率達(dá)到了75%，顯著高于其它四組