1、研究背景和目的
　　牙周病最普遍臨床表現(xiàn)為導(dǎo)致牙周支持組織的破壞及骨再生困難，近年來(lái)，骨組織工程學(xué)在牙周病學(xué)治療方面得到廣泛應(yīng)用研究，因此促進(jìn)骨再生方面細(xì)胞增殖、遷移及成骨是提高該類(lèi)疾病治愈率的關(guān)鍵。小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BoneMarrow Stromal Cell Line，ST2)是一種多能干細(xì)胞，取自源于小鼠體內(nèi)，研究證明其擁有來(lái)源廣泛并在一定條件下具有成脂、成骨、成軟骨細(xì)胞能力的特點(diǎn)，因此作為基礎(chǔ)研究中優(yōu)秀的種子細(xì)胞也廣

2、為應(yīng)用在組織工程技術(shù)方面及原位組織工程技術(shù)。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, bFGF)及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(Stromal cell derived factor-1，SDF-1)在牙周組織再生及骨再生領(lǐng)域已得到廣泛研究。在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方面，目前種子細(xì)胞及生長(zhǎng)因子依然在很多方面受限，而原位組織工程技術(shù)(in situ engineering technique)的發(fā)展可以通過(guò)募集干細(xì)胞作用的各類(lèi)生長(zhǎng)

3、因子有效地解決這一個(gè)問(wèn)題。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子是近年來(lái)的明星生長(zhǎng)因子，得到了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。很多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)，bFGF能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖及其成骨且效果明顯。SDF-1則是經(jīng)典的趨化因子，對(duì)免疫、循環(huán)及中樞系統(tǒng)的發(fā)育有著關(guān)鍵作用，且SDF-1在受傷組織（心臟、腎、大腦、皮膚及骨髓）中高表達(dá)，其表達(dá)的提高被認(rèn)為是促進(jìn)干細(xì)胞和前體細(xì)胞遷移進(jìn)行組織修復(fù)再生的重要信號(hào)。但是對(duì)于二者對(duì)于ST2細(xì)胞增殖遷移的差異并無(wú)相關(guān)研究

4、，其細(xì)胞機(jī)制也不清楚。
　　各種細(xì)胞的增殖遷移涉及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，目前研究較多并得到相關(guān)文獻(xiàn)資料驗(yàn)證支持的是絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activatedproteinkinase，MAPK)家族外加PI3K/AKT信號(hào)通路，其對(duì)于細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化、凋亡等生理現(xiàn)象均有顯著作用。
　　本實(shí)驗(yàn)的目的在于為內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢理論提供依據(jù)，bFGF與SDF-1分別處理ST2細(xì)胞探究其增殖遷移方面的差異，為組織工程技

5、術(shù)選擇一種更為優(yōu)質(zhì)的生長(zhǎng)因子，并探討bFGF如何發(fā)揮其作用機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路，以及絲裂素活化蛋白激酶家族MAPK及PI3K/AKT是否在細(xì)胞增殖遷移中扮演重要的角色且孰輕孰重。
　　材料和方法
　　ST2細(xì)胞購(gòu)自日本Riken Cell Bank，采用體外培養(yǎng)ST2，進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇、凍存、傳代及培養(yǎng)等操作。細(xì)胞培養(yǎng)傳代，倒置相差顯微鏡下觀(guān)察，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)形態(tài)良好，繁殖能力強(qiáng)，即達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。1、將ST2細(xì)胞分為2組，分別為b

6、FGF實(shí)驗(yàn)組，SDF-1實(shí)驗(yàn)組，相關(guān)文獻(xiàn)參考，bFGF實(shí)驗(yàn)組因子濃度分別設(shè)置為0（對(duì)照組濃度）、10、20、40、80、100 ng/ml，SDF-1實(shí)驗(yàn)組因子濃度分別設(shè)置為0（對(duì)照組濃度）、50、100、200、400 ng/ml，分別置于無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48、72 h，通過(guò)Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒檢測(cè)不同濃度兩種生長(zhǎng)因子對(duì)于細(xì)胞增殖的影響，獲得增殖ST2細(xì)胞的最佳生長(zhǎng)因子濃度。2、實(shí)驗(yàn)共分為三組

7、:空白對(duì)照組，bFGF組（20 ng/ml），SDF-1組(200 ng/ml)，采用CCK8方法檢測(cè)不同濃度兩種因子在24h,48h時(shí)間對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。3、實(shí)驗(yàn)共分為三組:空白對(duì)照組，bFGF組(20 ng/ml)，SDF-1組(200 ng/ml)，通過(guò)transwell小室法檢測(cè)不同濃度兩種因子對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞趨化的影響。4、實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)技術(shù)，分為用20 ng/mlbFGF刺激培養(yǎng)

8、骨髓基質(zhì)細(xì)胞0、5、10、15、30、60、120 min，根據(jù)時(shí)間進(jìn)行分組，觀(guān)察ST2細(xì)胞對(duì)于AKT/P-AKT、Erk/P-Erk蛋白相對(duì)表達(dá)含量的變化。5、實(shí)驗(yàn)采用western blot技術(shù)，分別單獨(dú)加入PI3K/AKT抑制劑LY294002，Erk抑制劑U0126+bFGF(10ng/ml)組對(duì)ST2細(xì)胞進(jìn)行活化，檢測(cè)各通路磷酸化蛋白的表達(dá)變化。6、實(shí)驗(yàn)分為兩組:抑制劑LY294002組及抑制劑U0126組，每組又分為單獨(dú)抑制

9、劑組、抑制劑+bFGF組，采用CCK8技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況變化，transwell小室法及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移變化。
　　結(jié)果:
　　1、與空白對(duì)照組相比，24h時(shí)bFGF實(shí)驗(yàn)組在濃度為10、20、40、80 ng/ml時(shí)對(duì)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞系增殖有促進(jìn)作用(p＜0.05)，相反地在bFGF濃度為100 ng/ml時(shí)，表現(xiàn)為高濃度抑制作用(p＜0.05)，且最佳濃度為20ng/ml。SDF-1實(shí)驗(yàn)組在濃度為50、100ng/ml

10、對(duì)ST2細(xì)胞增殖有效果，濃度為200ng/ml可有效促進(jìn)細(xì)胞增殖最佳(p＜0.05)，相反地濃度為400ng/ml時(shí)對(duì)ST2細(xì)胞增殖表現(xiàn)出高濃度抑制(p＜0.05)，且最佳濃度為200ng/ml。
　　2、經(jīng)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示:與空白對(duì)照組相比，在24、48、72h時(shí)間，20 ng/mlbFGF和200 ng/ml SDF-1均能促進(jìn)ST2細(xì)胞增殖(p＜0.01)，同時(shí)，20 ng/ml bFGF組較之于200 ng/ml

11、SDF-1組效果更為顯著(p＜0.01)。
　　3、經(jīng)transwell小室法檢測(cè)，與空白對(duì)照組相比，20 ng/mlbFGF和200 ng/ml SDF-1對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2均有遷移趨化作用(p＜0.01)，且bFGF的遷移趨化作用較SDF-1更為明顯(p＜0.01)。
　　4、相同劑量的20 ng/ml bFGF刺激ST2細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸化AKT、Erk的表達(dá)逐漸升高，分別在30min、15min

12、時(shí)磷酸化AKT、Erk表達(dá)到頂峰，隨后磷酸化逐漸降低。
　　5、給予ST2細(xì)胞關(guān)于PI3K/AKT、MAPK相關(guān)通路Erk特異性阻斷劑進(jìn)行處理，經(jīng)Western Blot測(cè)定驗(yàn)證，與空白對(duì)照組相比，單獨(dú)抑制劑組磷酸化蛋白表達(dá)含量降低，抑制劑預(yù)處理后加生長(zhǎng)因子組相關(guān)蛋白磷酸化較空白組升高但與單獨(dú)生長(zhǎng)因子組比較含量降低。
　　6、將PI3K/AKT, MAPK相關(guān)通路Erk特異性阻斷劑LY294002及U0126對(duì)ST2細(xì)胞進(jìn)行

13、處理，CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，transwell小室及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)均可同等證明PI3K/AKT通路能更好的阻斷細(xì)胞的增殖與遷移，加入bFGF生長(zhǎng)因子細(xì)胞生理狀況不會(huì)有明顯改善，但是MAPK/Erk通路可后續(xù)被bFGF生長(zhǎng)因子再次激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移。
　　結(jié)論
　　bFGF和SDF-1處理ST2細(xì)胞后，細(xì)胞增殖遷移確有增強(qiáng)，最佳有效濃度分別為20 ng/ml和200 ng/ml，且20 ng/ml bFGF增殖遷移效果優(yōu)