1、目的:建立大腦雙側(cè)海馬注射Aβ25-35的阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)大鼠模型,并采用過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞作為神經(jīng)損傷的細(xì)胞模型,從抗氧化機(jī)制探討咯利普蘭(Rolipram,Rol)對(duì)AD大鼠的保護(hù)作用。
　　 方法:從在體和離體兩方面來(lái)研究咯利普蘭對(duì)AD的抗氧化作用。
　　 1.在體實(shí)驗(yàn)
　　 (1)AD模型的建立及分組

2、與給藥成年雄性SD大鼠大腦雙側(cè)海馬注射Aβ25-35,造成AD模型后隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(大腦雙側(cè)海馬注射無(wú)菌生理鹽水)、模型組(Aβ25-35組)、咯利普蘭低劑量組(0.1 mg/kg)、咯利普蘭中劑量組(0.5 mg/kg)、咯利普蘭高劑量組(1.25 mg/kg)。動(dòng)物造模24h后,假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水(10 ml/kg,ip),其余各組腹腔注射給予10％DMSO無(wú)菌生理鹽水配制的藥物。
　　 (2)AD大鼠學(xué)習(xí)

3、記憶能力行為學(xué)測(cè)試AD大鼠注射Aβ25—35后,第14-15天進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn),第16-25天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。
　　 (3)AD大鼠病理組織學(xué)觀察AD大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)后處死取腦,多聚甲醛溶液中避光保存做HE染色和尼氏染色的病理切片。
　　 (4)AD大鼠活性氧簇與抗氧化酶系統(tǒng)的測(cè)定AD大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)后處死取腦,分離海馬和皮層,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)海馬和皮層中羥自由基(·OH)、超氧陰離子(·O2-)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽

4、(GSH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)水平。采用Western blot法測(cè)定海馬和皮層中硫氧還蛋白(thiorcdoxin,Trx)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表達(dá)水平。采用Real time-RT-PCR法測(cè)定海馬和皮層中Trx和iNOS mRNA表達(dá)水平。
　　 2.離體實(shí)驗(yàn):
　　 (1)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型的建立PC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)液每天更換一次,2-3

5、天傳代接種。細(xì)胞加藥處理前采用血清饑餓法使之同步化。加入H2O2(終濃度20～200μmol/L)分別孵育4、6、8、12、18 h,用噻唑藍(lán)(MTT)法確立PC12細(xì)胞損傷模型。
　　 (2)咯利普蘭對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用細(xì)胞用咯利普蘭和H2O2處理后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,MTT法測(cè)定細(xì)胞活力；根據(jù)乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞外LDH水平,用以檢測(cè)細(xì)胞膜通透性及完整性。收集細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)

6、定細(xì)胞周期分布。
　　 (3)咯利普蘭對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用細(xì)胞用咯利普蘭和H2O2處理后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中·OH、·O2-、MDA、GSH、NO和SOD水平。采用Western blot法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Trx和iNOS蛋白表達(dá)水平。采用Real time-RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Trx和iNOS mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:從在體和離體兩方面結(jié)果來(lái)研究咯利普蘭對(duì)A

7、D的影響。
　　 1.在體實(shí)驗(yàn)
　　 (1)咯利普蘭對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響反復(fù)注射PDE4抑制劑咯利普蘭能夠顯著性改善AD大鼠在被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)和水迷宮的行為學(xué)。表現(xiàn)為在注射Aβ25-35之后第14-15天,AD大鼠在明箱停留時(shí)間較短,咯利普蘭各劑量處理組大鼠則停留時(shí)間較長(zhǎng),對(duì)暗箱不可逃避的電刺激有較牢固的記憶。在水迷宮測(cè)試中,大鼠在水迷宮靶向獲得性試驗(yàn)中需要更長(zhǎng)的時(shí)間(與假手術(shù)相比)才能找到平臺(tái),而咯利普蘭各劑量處理

8、組大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間縮短；而且,在探索性實(shí)驗(yàn)(移去平臺(tái))中,經(jīng)咯利普蘭各劑量干預(yù)的AD大鼠在目標(biāo)象限(即曾經(jīng)放置平臺(tái)的象限)空間探索的時(shí)間延長(zhǎng)。在可見(jiàn)平臺(tái)測(cè)試中,各組大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間均無(wú)顯著性差異,排除了手術(shù)對(duì)動(dòng)物一般活動(dòng)行為的影響。
　　 (2)咯利普蘭對(duì)AD大鼠病理組織學(xué)的影響HE染色:假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊均勻,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。模型組海馬CA1區(qū)有結(jié)構(gòu)較松散的軟化灶,部分神經(jīng)細(xì)胞呈缺血性形態(tài),胞體縮小,胞核

9、固縮,細(xì)胞數(shù)減少,胞間距離增大,神經(jīng)元排列紊亂?？├仗m各劑量組海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較多,排列較密,胞核圓或橢圓形,核仁清晰,染色質(zhì)豐富,少見(jiàn)固縮變性的神經(jīng)細(xì)胞。
　　 尼氏染色:假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊,胞體較大、細(xì)胞層次清晰,胞質(zhì)內(nèi)尼氏體數(shù)量多。模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊,數(shù)目減少,神經(jīng)元排列明顯疏松,皺縮成三角形或錐形,神經(jīng)元胞體和樹(shù)突內(nèi)尼氏體溶解消失。咯利普蘭各劑量組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊,神

10、經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)尼氏體較模型組增多。
　　 (3)咯利普蘭對(duì)AD大鼠活性氧簇與抗氧化酶系統(tǒng)的影響SD大鼠注射Aβ25-35后,海馬和皮層抑制·OH和·O2-活性能力顯著性下降(P<0.01),與模型組相比,咯利普蘭各劑量組海馬和皮層抑制·OH和·O2-活性能力顯著性增加(P<0.05),具有劑量依賴性趨勢(shì)。
　　 SD大鼠注射Aβ25-35后,海馬和皮層MDA、LDH和NO水平顯著性提高(P<0.01),GSH水平和SOD活性

11、顯著性下降(P<0.01)。與模型組相比,咯利普蘭各劑量組海馬和皮層中MDA、LDH和NO水平顯著性降低(P<0.05),GSH水平和SOD活性顯著性升高(P<0.05),具有劑量依賴性趨勢(shì)。
　　 Western blot結(jié)果顯示,SD大鼠注射Aβ25-35后:海馬Trx蛋白表達(dá)水平顯著性降低,iNOS蛋白表達(dá)水平顯著性升高(P<0.01),咯利普蘭各劑量組均能顯著性提高海馬Trx蛋白表達(dá)水平,降低海馬iNOS蛋白表達(dá)水平(P

12、<0.05),具有劑量依賴性趨勢(shì),但皮層Trx和iNOS蛋白表達(dá)水平各組間均沒(méi)有顯著性差異。
　　 Real time-RT-PCR結(jié)果顯示,SD大鼠注射Aβ25-35后:海馬和皮層TrxmRNA表達(dá)水平顯著性差異降低,iNOS mRNA表達(dá)水平顯著性差異提高(P<0.01)?？├仗m各劑量組均能顯著性提高海馬。Trx mRNA表達(dá)水平,降低海馬iNOS mRNA表達(dá)水平(P<0.01),具有劑量依賴性趨勢(shì)。咯利普蘭0.5mg/

13、kg和1.25mg/kg組能顯著性提高皮層Trx mRNA表達(dá)水平,降低皮層iNOS mRNA表達(dá)水平(P<0.01)。
　　 2.離體實(shí)驗(yàn)
　　 (1)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型倒置顯微鏡下觀察,空白對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)牢固,體積飽滿,充分伸展,而損傷組PC12細(xì)胞體積明顯縮小,突起消失,胞體變小,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞分布變稀疏的,出現(xiàn)不同程度的脫壁。損傷程度隨H2O2濃度的升高加深。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照

14、組相比,H2O2(終濃度40μmol/L)作用16h能顯著性降低細(xì)胞活力(P<0.01),且該濃度較溫和,為適宜的濃度和作用時(shí)間。
　　 (2)咯利普蘭對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用MTT結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比,H2O2(終濃度40μmol·L-1)作用16 h能顯著性降低細(xì)胞的存活率(P<0.05),細(xì)胞存活率為57.8％。不同濃度的咯利普蘭預(yù)孵均能顯著性降低H2O2對(duì)細(xì)胞的毒性作用(P<0.05),且

15、具有濃度依賴性。
　　 LDH結(jié)果顯示:H2O2損傷組PC12細(xì)胞,膜外LDH水平顯著升高(P<0.01),咯利普蘭20μmol·L-1與40μmol·L-1兩濃度可顯著性降低膜外LDH水平(P<0.01)。
　　 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,H2O2刺激下,G0/G1期細(xì)胞分布百分比明顯升高(P<0.01),S期細(xì)胞分布百分比明顯降低(P<0.01)。咯利普蘭(20和40μmol·L-1)顯著減少G0/G1期細(xì)胞分布百分比(P

16、<0.05),增加S期細(xì)胞分布百分比(P<0.01),(3)咯利普蘭對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞抗氧化保護(hù)作用H2O2可以使細(xì)胞清除·OH和·O2-的能力明顯下降(P<0.01)?？├仗m各濃度組均可不同程度地提高細(xì)胞清除·OH和·O2-的能力(P<0.01),且具有濃度依賴性趨勢(shì)。
　　 H2O2損傷后,PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA和NO水平明顯升高(P<0.01),GSH含量和SOD活性明明顯降低(P<0.01)?？├?/p>

17、蘭各濃度組均可顯著性降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA和NO水平(P<0.01),提高GSH含量(P<0.05),具有濃度依賴性趨勢(shì)；咯利普蘭40μmol·L-1組顯著性提高PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD活性(P<0.01)。
　　 Western blot結(jié)果顯示,H2O2使細(xì)胞內(nèi)Trx蛋白水平明顯降低(P<0.01),iNOS蛋白水平明顯提高(P<0.01)?？├仗m各濃度組均能明顯提高Trx表達(dá)(P<0.01),具有濃度依賴性的趨

18、勢(shì)；咯利普蘭40μmol·L-1組能明顯降低iNOS表達(dá)(P<0.01)。
　　 Real time-RT-PCR結(jié)果顯示,H2O2處理后,Trx mRNA下調(diào)(P<0.01),iNOSmRNA上調(diào)(P<0.01)?？├仗m各濃度組均能顯著性上調(diào)Trx mRNA(P<0.01),下調(diào)iNOS mRNA(P<0.05),具有濃度依賴性的趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:我們采用大腦雙側(cè)海馬注射Aβ25-35造AD大鼠模型,以及采用H2O

19、2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷造成神經(jīng)損傷體外模型,在體與離體給予咯利普蘭干預(yù),通過(guò)生化指標(biāo)及病理的指標(biāo)觀察咯利普蘭對(duì)AD的抗氧化作用,主要結(jié)論如下:
　　 (1)咯利普蘭對(duì)AD大鼠具有抗氧化保護(hù)作用,主要表現(xiàn)在:反復(fù)注射咯利普蘭能明顯改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；顯著性改善大鼠海馬CA1區(qū)的病理?yè)p傷；明顯提高AD大鼠海馬和皮層中抗氧化酶系統(tǒng)活性和硫氧還蛋白系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力,抑制氧自由基及iNOS-NO通路的激活。
　　 (2)咯利