1、背景和目的:
　　 超聲造影劑(ultrasound contrast agent,UCA)是在超聲成像中用來(lái)增強(qiáng)圖像對(duì)比度的物質(zhì)。經(jīng)過(guò)近四十年的發(fā)展,超聲造影劑已由殼膜包裹惰性氣體的第二代發(fā)展到鏈接配體實(shí)現(xiàn)特異性分子成像的第三代造影劑-靶向微泡,由血池示蹤的微米級(jí)泡發(fā)展到能透過(guò)病灶新生血管內(nèi)皮實(shí)現(xiàn)病變組織成像的納米級(jí)泡。第三代超聲造影劑應(yīng)用于臨床還需要解決幾大問(wèn)題,其中的關(guān)鍵問(wèn)題是造影劑的表面修飾,即如何將特異性好、活性高的配

2、體牢固高效地結(jié)合到微泡表面。但目前的造影劑(包括白蛋白類及磷脂類)缺乏活性基團(tuán),不易與配體鏈接以致配體結(jié)合率低下,而且粒徑過(guò)大,不能透過(guò)病變血管內(nèi)皮實(shí)現(xiàn)病灶定點(diǎn)成像,已經(jīng)不能滿足靶向造影劑的發(fā)展需要。因此研究開(kāi)發(fā)易修飾的新型LJCA具有巨大的研究和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。大量研究表明多聚合物及多糖類材料價(jià)格相對(duì)低廉,含有大量的活性基團(tuán),易于修飾,是目前乃是將來(lái)超聲造影劑研制中最具有前途的包膜材料。
　　 殼聚糖集聚合物和多糖材料的優(yōu)點(diǎn)于一

3、身,表面活性優(yōu)良,它不但無(wú)毒、無(wú)刺激性,生物可降解性及生物相容性良好,而且具有獨(dú)特的生理和藥理活性,已經(jīng)被廣泛各種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。但殼聚糖水溶性差,要想用作殼膜材料必須對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或加入特定的交聯(lián)劑。有報(bào)道采用N-羧甲基殼聚糖制備UCA,但制備工藝復(fù)雜,且容易產(chǎn)生交聯(lián)劑戊二醛和正己烷的殘留。蔣剛彪等將軟脂?；霘ぞ厶欠肿又兄苽涑鰞捎H性殼聚糖高分子膠束--N-軟脂?；鶜ぞ厶?N-palmitoyl chitosan,PLCS)。這種兩

4、親性衍生物具有優(yōu)良的增溶、乳化和自組裝(自聚集)能力,最重要的是它含有豐富的自由氨基和羥基等活性基團(tuán),具有良好的修飾性,可以與許多藥物、基因或配體進(jìn)行共價(jià)鏈接而無(wú)需額外添加錨點(diǎn),而且這種化學(xué)修飾所需的反應(yīng)條件溫和,有利于保持鏈接物的生物活性。因此它是一種理想的微泡殼膜材料。
　　 本研究的目的是采用N-軟酯?；鶜ぞ厶菫闅つげ牧?制備新型的超聲微泡及納泡,用光學(xué)顯微鏡、Coulter計(jì)數(shù)儀、Zeta電位儀檢測(cè)其大小、形態(tài)、濃度和表

5、面電位,通過(guò)動(dòng)物超聲進(jìn)行造影效果的評(píng)價(jià)。通過(guò)改變輔助材料的劑量來(lái)優(yōu)化微泡配方并探討這些材料在殼聚糖微泡制備中的作用及其機(jī)理。
　　 材料和方法:
　　 1.N-軟脂?；鶜ぞ厶俏⑴?N-palmitoyl chitosan microbubbles,PCMB)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
　　 1.1 PCMB的制備將適量PLCS、十八醇縮水甘油醚(Octadecylglycidylether,OGE)、PEG-4000等殼膜材料加

6、入15ml蒸餾水中,在50℃水浴條件下輕輕攪拌溶解90min,定容至20ml,置入50ml注射器內(nèi),從注射器底部通入全氟丙烷氣體。將剪切儀置入液面下2.5cm處,以剪切儀第5檔(21000r/min)剪切40s后轉(zhuǎn)第6檔(24000 r/min)剪切80s。微泡制備后分裝入安培瓶中,填充全氟丙烷氣體并密封瓶口,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 1.2 PCMB粒徑優(yōu)化方案按照上述制備方法,將PLCS(0.03g)劑量不變,分別加入0％、

7、0.5％、1％、5％濃度的PEG-4000,制備成四組PCMB(分別為.PEG0％組、PEG0.5％組、PEG1％組、PEG5％組),以了解PEG-4000對(duì)PCMB粒徑、濃度、表面電位的影響；再將PLCS(0.03g)劑量不變,分別加入0g、0.0015g、0.003g、0.006g的十八醇縮水甘油醚,制備成四組PCMB(分別為OGE0g組、OGE0.0015g組、OGE0.003g組、OGE0.006g組),以了解十八醇縮水甘油醚對(duì)

8、PCMB粒徑、濃度、表面電位的影響。各組PCMB均制備6個(gè)批次。
　　 1.3 PCMB理化性質(zhì)檢測(cè)每組殼聚糖微泡均取一小滴滴至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,用光學(xué)顯微鏡觀察微泡的形態(tài)、大小、分布；取50μl PCMB稀釋2000倍后用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)定微泡的濃度和平均粒徑；取100μl微泡稀釋50倍用Zeta電位儀分析微泡表面電位值。
　　 2優(yōu)化后N-軟脂?；鶜ぞ厶俏⑴莸男阅軝z測(cè)
　　 2.1優(yōu)化后PCMB的制備將0.03g

9、 PLCS、0.003g十八醇縮水甘油醚、0.2gPEG-4000制備PCMB,制備步驟同步驟(1.1)。
　　 2.2優(yōu)化后PCMB的理化性質(zhì)檢測(cè)微泡的形態(tài)、大小、分布的檢測(cè)步驟同步驟(1.3)。取微泡制備后、2個(gè)月后、6個(gè)月后三個(gè)時(shí)間段進(jìn)行上述檢測(cè)以評(píng)價(jià)PCMB的體外穩(wěn)定性。
　　 2.3優(yōu)化后PCMB的超聲造影檢測(cè)
　　 造影劑分為:PCMB1組(制備后)、PCMB2組(制備后4℃保存6個(gè)月)、全氟顯組。每

10、只大鼠經(jīng)尾靜脈依次團(tuán)注上述三種造影劑0.1ml,注射后用少量生理鹽水沖管。逐次行左心室、肝臟、腎臟超聲造影檢查。重復(fù)注射時(shí)間隔時(shí)間大于15min。
　　 超聲造影使用Sequoia512超聲診斷儀,將超聲探頭分別固定于大鼠左心室、肝臟、腎臟體表,待二維圖像調(diào)整滿意后,超聲探頭位置、儀器增益、掃描深度保持不變,以CPS模式行超聲造影檢測(cè)并將全部造影結(jié)果存儲(chǔ)于DVD盤中。超聲圖像用Siemens Syngo ACQ分析系統(tǒng)分析,獲取

11、峰值強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間、峰值減半時(shí)間、廓清時(shí)間等參數(shù)。
　　 3 N-軟脂?；鶜ぞ厶羌{泡的制備及其理化性質(zhì)檢測(cè)
　　 3.1納泡的制備取適量N-軟脂?；鶜ぞ厶羌尤胝麴s水15ml,余制備步驟同步驟(1.1)。
　　 3.2納泡基本特征及穩(wěn)定性的測(cè)定納泡制備后于24小時(shí)、45天、90天分別進(jìn)行下列檢測(cè):通過(guò)光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察納泡的形態(tài),馬爾文粒度分析儀檢測(cè)納泡的大小,Zeta電位儀分析納泡表面電位。
　　

12、3.3納泡超聲造影檢測(cè)檢測(cè)步驟同步驟(2.3)。每只大鼠經(jīng)尾靜脈注入0.1ml納泡,行大鼠腎臟、心臟超聲造影檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 1 N-軟脂?；鶜ぞ厶俏⑴莸膬?yōu)化實(shí)驗(yàn)
　　 1.1 PEG-4000對(duì)PCMB的影響未加入PEG-4000的PCMB為細(xì)小而大小均一的納泡,濃度最高,為(6.52±0.48)×109個(gè)/ml,平均直徑為(601±20)nm,表面電位為(52.3±0.5)mV；加入PEG-4000

13、后,微泡濃度逐漸降低,粒徑逐漸增大,達(dá)到微米級(jí)；當(dāng)PEG-4000的濃度達(dá)到1％時(shí),PCMB濃度為(2.21±0.58)×109個(gè)/ml,平均粒徑為(1277±31)nm。PEG-4000的濃度與PCMB的表面電位呈反比關(guān)系,PEG-4000劑量越大,PCMB表面電位越低。
　　 1.2十八醇縮水甘油醚對(duì)PCMB的影響未加入OGE的PCMB為細(xì)小而大小均一的納泡,平均直徑為(601±20)nm,濃度最高,為(6.52±0.48)

14、×109個(gè)/ml,表面電位為(52.3±0.5)mV；加入OGE后造影劑的濃度逐漸降低；當(dāng)加入小劑量的OGE(0.0015g)時(shí),PCMB的粒徑卻較前明顯增大,達(dá)到亞微米級(jí),平均粒徑為(1315±24)nm；繼續(xù)增加OGE的用量則PCMB的粒徑逐漸下降。OGE對(duì)PCMB表面電位沒(méi)有顯著影響。
　　 2優(yōu)化后PCMB的性能檢測(cè)
　　 2.1優(yōu)化PMCB的理化特征檢測(cè)微泡濃度為(2.88±0.45)×109/ml,平均粒徑為

15、(1.31±0.07)μm,表面電位為(43.4±1.3)mV。微泡保存2個(gè)月及6個(gè)月后濃度和大小與制備初時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCMB的濃度顯著高于全氟顯[(2.88±4.49)×109/ml比(1.34±0.34)×109/ml,P<0.001],平均直徑則明顯小于全氟顯[(1.31±0.07)μm比(2.87±0.40)μm,P<0.001]。
　　 2.2超聲造影效果
　　 2.2.1 PCMB與全氟顯超聲造影比較

16、兩者峰值強(qiáng)度和達(dá)峰時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PCMB的峰值減半時(shí)間和廓清時(shí)間則長(zhǎng)于全氟顯[其中峰值減半時(shí)間約為(4—5.5)min比(2-3)min,廓清時(shí)間約為(7-9)min比(3-4.5)min,P<0.05]。
　　 2.2.2保存6個(gè)月的PCMB與剛制備的PCMB超聲造影比較兩者峰值強(qiáng)度和達(dá)峰時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腎臟造影時(shí)兩者峰值減半時(shí)間和廓清時(shí)間相近,而心臟和肝臟造影時(shí)前者較后者縮短[其中心臟造影分別

17、為(245.9±21.8)s比(316.0±23.9)s,(399.9±22.7)s比(545.4±18.1)s；肝臟造影分別為(233.6±17.5)s比(336.4±22.9)s,(394.6±23.0)s比(489.9±29.4)s,P<0.001]。
　　 3 N-軟脂酰基殼聚糖納泡的制備及其理化性質(zhì)檢測(cè)
　　 3.1納泡理化性質(zhì)和穩(wěn)定性顯微鏡和透射電鏡下觀察,各時(shí)間點(diǎn)納泡均呈空心球形結(jié)構(gòu)、大小較均一、無(wú)聚集現(xiàn)象

18、。靜置24h后的納泡平均粒徑為(612±14)nm,濃度為(7.1±0.5)×109/ml,Zeta電位為(52.3±0.5)mV。與制備后24h的納泡相比,靜置45天和90天后納泡平均粒徑、濃度和Zeta電位之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3.2納泡超聲顯像檢測(cè)大鼠腎臟、心臟超聲顯影得到明顯增強(qiáng)。腎臟對(duì)比顯影最大聲強(qiáng)度為(15-17)GU,心臟對(duì)比顯影最大聲強(qiáng)度為(26-30)GU,在兩種組織中可視性顯影增強(qiáng)持

19、續(xù)時(shí)間為10min左右。
　　 結(jié)論:
　　 1.以N-軟脂?；鶜ぞ厶?、十八醇縮水甘油醚和PEG為殼膜材料成功制備出一種新型亞微米級(jí)超聲微泡,體外穩(wěn)定性好；行大鼠超聲造影顯示超聲顯像效果理想,體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)于全氟顯。
　　 2.十八醇縮水甘油醚OGE可增加PCMB的粒徑,當(dāng)與PLCS質(zhì)量比超過(guò)1:10時(shí)不再產(chǎn)生這種作用；對(duì)PCMB表面電位不產(chǎn)生顯著影響。聚乙二醇有助于增加微泡的粒徑,并使粒徑分布變窄；能顯著降低微