1、免疫磁性微球定向富集稀樣本中的靶物質(zhì)具有特異性強(qiáng)、高效快速等優(yōu)點(diǎn)。本課題首先用牛乳源蛋白β-CN免疫大白兔制備得到抗血清，經(jīng)鹽析和層析純化后得到兔抗β-CNIgG;對(duì)反相懸浮乳液包埋法制備磁性微球的條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)制備得到的微球進(jìn)行醛基化和嗜硫修飾，并同未修飾微球一起進(jìn)行了抗體吸附和抗原富集的性能比較，確定最優(yōu)修飾方法;用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，標(biāo)記鹽析IgG后用于金標(biāo)墊的包被，檢測(cè)墊經(jīng)層析IgG和二抗包被后組裝各部件得到β-CN

2、膠體金免疫層析試紙條，對(duì)其靈敏性、特異性及穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)試，并用其對(duì)三種免疫磁性微球的抗原富集液進(jìn)行定性檢測(cè)。
　　 特異性多克隆抗體的制備。選取牛乳源蛋白β-CN做為抗原免疫大白兔，頸動(dòng)脈取血后得到的抗血清用飽和硫酸銨分級(jí)鹽析法(50％、40％、33％)粗分離抗體，用蛋白A親和色譜柱對(duì)粗分離的抗體進(jìn)行層析純化?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定鹽析和層析樣品的蛋白含量分別為2.42μg/ml和1.06μg/ml，其中層析樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)

3、分析得抗體純度達(dá)到95％以上，用間接ELISA法測(cè)定兩者效價(jià)均為1∶8000。
　　 殼聚糖/明膠磁性微球的制備。采用反相懸浮乳液包埋法制備磁性微球并進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳方案為:水相為3％殼聚糖-2％明膠-1％磁性粒子;油相液體石蠟/乳化劑span-80為1∶0.03;水油比為1∶4;最佳乳化時(shí)間8-10min;最佳轉(zhuǎn)速575r/min;固化交聯(lián)劑25％戊二醛加入量為0.5ml/5ml水相樣品;磁性微球洗滌順序?yàn)槭兔?、丙?

4、水3∶1、異丙醇。得到的磁性微球經(jīng)SEM拍照觀察粒徑在3-8μm范圍內(nèi)，磁響應(yīng)性良好。
　　 磁性微球修飾及性能比較。對(duì)微球進(jìn)行醛基化和嗜硫修飾，同未修飾微球一起進(jìn)行磁響應(yīng)性、BSA吸附效果、抗體吸附量、抗體吸附穩(wěn)定性及抗原富集效果的比較，其中醛基化磁性微球各項(xiàng)性能均優(yōu)于其它兩種，每1g醛基化微球的IgG吸附量為118.5μg/ml，經(jīng)抗原解析劑作用后抗體保留率為94.47％，用醛基化免疫磁性微球富集抗原β-CN后，其富集液中抗

5、原純度較高，抗原富集倍數(shù)為3.19。
　　 免疫膠體金制備。采用檸檬酸三鈉還原法制備穩(wěn)定無沉淀的膠體金溶液，用鹽析兔抗β-CNIgG對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，確定最佳標(biāo)記量為鹽析兔抗β-CNIgG（242μg/ml）26μl/ml膠體金，最佳標(biāo)記pH是8.0，制備免疫膠體金溶液并進(jìn)行純化，間接ELISA測(cè)定其效價(jià)為1∶800。
　　 β-CN膠體金免疫層析試紙條制備。通過優(yōu)化試驗(yàn)確定試紙條各部分處理如下，金標(biāo)墊（玻璃纖維素膜）用PB

6、S1∶1稀釋的免疫膠體金包被;硝酸纖維素膜上T線用400μg/ml兔抗β-CNIgG畫線包被6次共3μl，C線用200μg/ml羊抗兔IgG畫線包被3次共1.5μl，各部件準(zhǔn)備好后組裝試紙條。β-CN膠體金免疫層析試紙條對(duì)β-CN標(biāo)準(zhǔn)溶液和脫脂牛乳檢出線均為31.25μg/ml。用試紙條對(duì)未修飾、醛基化、嗜硫化免疫磁性微球的β-CN富集液進(jìn)行定性檢測(cè)，結(jié)果分別為弱陽性、強(qiáng)陽性和弱陽性，表明富集過程對(duì)抗原的反應(yīng)原性未產(chǎn)生影響，并且制備的試