1、研究背景：皮膚是人體最大的器官，除了通過分泌、排泄和調節(jié)體溫來參與機體的新陳代謝外，更重要的是它覆蓋全身，是保護體內各組織和器官的屏障，因此十分容易受到損傷。皮膚缺損往往繼發(fā)于創(chuàng)傷、手術、燒傷或一些代謝性疾病如糖尿病等，所以皮膚的損傷易伴發(fā)感染，形成壞疽，嚴重時甚至可以威脅生命，因此皮膚缺損的治療，尤其是難愈合性創(chuàng)傷及大面積全層皮膚缺損，一直以來都是國內外皮膚及整形外科亟待解決的醫(yī)學難題。近年來，組織工程快速發(fā)展，已有大量研究報道利用骨

2、髓間充質干細胞（BMMSCs）作為種子細胞構建組織工程皮膚，通過間充質干細胞（MSCs）的自我更新、高度增殖與多向分化使其成為創(chuàng)傷愈合豐富的細胞來源，從而修復皮膚缺損。然而，現(xiàn)有的幾種組織工程化皮膚雖然在治療皮膚缺損上取得了一定成效，但它們大多只是在結構上與人體天然皮膚相似，雖然具有皮膚的屏障功能，但其韌性、外形以及機械性能仍明顯不如天然皮膚，并且在免疫、物質及能量交換等功能方面上仍有較大差距，并沒有實現(xiàn)真正意義上的皮膚重建。近來，MS

3、Cs的免疫調節(jié)能力受到越來越多的關注，應用其免疫調節(jié)特性來治療各種疾病也顯示了較傳統(tǒng)治療難以比擬的優(yōu)勢，然而巨噬細胞（mΦ）作為損傷愈合中的免疫明星細胞，其在MSCs的系統(tǒng)注射調節(jié)免疫從而促進皮膚損傷愈合中是否發(fā)揮作用，發(fā)揮怎樣的作用卻鮮有報道。明確各細胞在皮膚缺損的細胞治療中發(fā)揮的作用有利于更深刻的理解MSCs在皮膚缺損修復中對病理過程的潛在影響，從而在臨床上為皮膚缺損愈合的治療手段提供新思路。
　　研究目的：本實驗目的在于篩選

4、合適的種子細胞，探索干細胞治療促進皮膚缺損愈合的可行性，明確其效應的靶細胞及可能作用機制，為臨床治療皮膚缺損修復再生提供一定的理論依據及治療新思路。
　　方法：
　　1.體外組織塊培養(yǎng)法和有限稀釋法培養(yǎng)頜骨骨髓間充質干細胞（JMMSCs）；骨髓穿刺法和密度梯度離心法培養(yǎng)長骨骨髓間充質干細胞。流式細胞儀鑒定細胞表面抗原標記；克隆形成、細胞周期以及Cell count kit8（CCK8）檢測細胞自我更新能力；細胞遷移實驗比較兩

5、種細胞的遷移效率；成骨誘導后通過檢測堿性磷酸酶（ALP）活性，ALP染色、茜素紅染色，實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）及蛋白免疫印跡法（Western Blot）比較兩種細胞成骨能力；成脂誘導后通過油紅“O”染色，RT-PCR及Western Blot比較兩種細胞脂向分化能力。
　　2.建立小鼠皮膚缺損模型（n=48），隨機分為A組（BMMSCs組，I.V.，2×106)，B組（JMMSCs組，I.V.，2×106）和對照組C

6、組（PBS組，I.V.，200μL），觀察不同時間點各組皮膚缺損愈合情況并進行組織切片的蘇木素伊紅（HE）、免疫組織化學及特殊染色，比較不同組別皮膚缺損愈合效率及炎細胞浸潤，血管生成，生長因子分泌、細胞增殖及膠原纖維形成。
　　3.CM-DIL染色對干細胞標記和體內示蹤，免疫熒光染色探索創(chuàng)緣處“歸巢”MSCs可能作用的靶細胞；通過氯膦酸二鈉的脂質體（CL）尾靜脈注射建立巨噬細胞刪除小鼠模型，在此基礎上行皮膚缺損（n=20），隨機分

7、為D組（BMMSCs（mΦ-）組，I.V.，2×106）及對照E組（PBS（mΦ-）組，I.V.，200μL），觀察不同時間點皮膚缺損愈合大體情況并進行組織切片的HE、免疫組織化學及特殊染色，比較不同組別皮膚缺損愈合效率，血管生成，生長因子分泌、細胞增殖及膠原纖維形成。
　　4.密度梯度法及磁珠分選分離出外周血中的單核細胞，將其與兩種干細胞進行共培養(yǎng)，流式細胞儀與細胞免疫熒光檢測巨噬細胞表面標志的變化，脂多糖（LPS）及白細胞介素

8、（IL）-4分別刺激巨噬細胞得到M1、M2型巨噬細胞，RT-RCR檢測共培養(yǎng)后的巨噬細胞與誘導得到的M1、M2型巨噬細胞M1/M2型相關基因mRNA表達水平差異，組織免疫熒光檢測細胞治療組（A、B組）和PBS組（C組）皮膚缺損周圍組織巨噬細胞表面標志變化，RT-PCR和Western Blot分別檢測組織中巨噬細胞M1/M2型極化相關基因及蛋白表達變化。
　　結果：
　　1.分離的JMMSCs和BMMSCs均陽性表達CD14

9、6、STRO-1、CD105，陰性表達CD31、CD34、CD45；JMMSCs的克隆形成率、增殖速度高于BMMSCs，流式細胞術檢測顯示JMMSCs處于增殖（S+G2）期的細胞占35.89％，多于BMMSCs的增殖期細胞所占百分比30.41%，而遷移速率上兩者無明顯差異；成骨誘導3、5、7天后，ALP活性檢測及染色結果顯示兩種細胞的ALP活性隨著時間上升且JMMSCs強于BMMSCs，誘導21 d后茜素紅染色及定量顯示JMMSCs礦化

10、能力強于BMMSCs，RT-PCR和Western Blot顯示相關成骨指標JMMSCs強于BMMSCs；成脂誘導后，油紅“O”染色及定量、RT-PCR和Western Blot顯示BMMSCs成脂能力稍強于JMMSCs組。
　　2.從第6天開始，A、B兩組小鼠皮膚缺損的愈合效率明顯快于C組；Manson三色染色顯示，A、B組形成的藍色纖維較C組多且方向更整齊；HE染色顯示治療3天后，A、B兩組傷口附近炎細胞浸潤明顯少于對照C組；

11、免疫組化顯示在細胞治療后第9天時，A、B兩組的增殖細胞核抗原（PCNA），血小板生成衍生因子（PDGF）和CD31陽性細胞多于C組。
　　3.CM-DiL標記的MSCs大量“歸巢”到皮膚缺損處，數(shù)量明顯多于正常皮膚處的標記MSCs，并于與創(chuàng)緣周圍大量CD68陽性的巨噬細胞在空間上有密切聯(lián)系；流式細胞術檢測小鼠CL注射后，外周血中高表達CD14中等表達CD45的單核細胞大量減少，脾和肝的中CD68陽性細胞較正常小鼠中減少，表明巨噬細

12、胞刪除小鼠模型建立成功；巨噬細胞刪除小鼠的皮膚缺損進行細胞治療后（D組），其愈合效率與PBS治療的對照組（E組）沒有明顯差異，Manson三色染色顯示D、E兩組基本沒有藍色的膠原纖維形成；在細胞治療的第9天，D、E兩組的PCNA，PDGF和CD31免疫組化染色的陽性細胞數(shù)量沒有明顯差異。
　　4.流式細胞儀、細胞免疫熒光檢測顯示與兩種干細胞共培養(yǎng)后，表達M2型巨噬細胞標志CD206和CD163的巨噬細胞比例上升；RT-PCR檢測經

13、共培養(yǎng)的巨噬細胞表達M2型相關基因水平較LPS誘導的M1型巨噬細胞和未誘導組高，接近于經IL-4誘導的M2型巨噬細胞的表達水平。組織免疫熒光，RT-PCR及Western Blot都顯示相較PBS組，MSCs治療組皮膚缺損處巨噬細胞的M2型比例增加。
　　結論：
　　1.頜骨來源的JMMSCs是異于長骨骨髓來源的BMMSCs的獨立細胞群體，其易于獲得分離,在體外可以迅速擴增，在一定條件下同樣也是合適的種子細胞。
　　2