1、葡萄糖、蛋白質和脂肪的三大代謝是哺乳動物細胞獲得能量的主要方式。其中正常組織主要是依靠葡萄糖通過糖酵解途徑提供能量，糖酵解途徑中產生的中間代謝產物能夠為蛋白質代謝和脂肪代謝的相關途徑提供原材料，使得三大代謝途徑能夠緊密地聯系起來。糖酵解途徑一共有十個反應，其中存在三個關鍵調控步驟，己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是調控步驟中的三個關鍵酶。在氧氣充足的情況下葡萄糖有氧氧化產生的丙酮酸經過氧化脫羧形成乙酰輔酶A將最終進入三羧酸循環(huán)提供能量

2、。在缺氧的條件下，丙酮酸通過糖酵解途徑最終被氧化為乳酸，這就是正常組織的無氧糖酵解途徑。而上世紀20年代德國生物學家Otto Warburg發(fā)現腫瘤細胞在有氧條件下會利用葡萄糖進行糖酵解反應并產生大量的乳酸作為主要的代謝途徑，該有氧糖酵解現象被稱為Warburg效應。
　　己糖激酶(Hexokinase，HK)是糖酵解途徑中的首個限速關鍵酶。在哺乳類動物體內，己糖激酶存在有四種亞型（HK1，HK2，HK3和HK4），而在腫瘤細胞中

3、主要為己糖激酶2型(HK2)蛋白并且過度表達。蛋白質的O-GlcNAc糖基化修飾在細胞生命活動中扮演著重要的調控作用。O-GlcNAc糖基化的修飾異常能夠導致腫瘤、糖尿病、心臟病與阿爾茨海默病等多種神經退行性病變疾病的發(fā)生。本課題的研究目的就是鑒定HK2是否是O-GlcNAc糖基化蛋白質以及確定其糖基化位點，并且構建內源性HK2基因敲除的細胞株，為研究HK2的O-GlcNAc糖基化在腫瘤細胞中的生物學功能作用奠定基礎。
　　本課題

4、首先通過免疫共沉淀技術證實HK2是O-GlcNAc糖基化的蛋白質，然后通過質譜分析鑒定HK2糖基化的位點。質譜分析的HK2糖基化的樣本來自于體外標記，其具體方法如下:通過構建原核表達系統，利用大腸桿菌表達HK2以及OGT蛋白，經過親和層析純化獲得HK2和OGT蛋白，在體外對HK2蛋白進行O-GlcNAc糖基化標記，運用質譜分析的方法對HK2的O-GlcNAc糖基化位點進行初步鑒定，結果檢測到5個O-GlcNAc糖基化信號，這5個糖基化位

5、點分別是S32、T331、T336、S340和T762。由于O-GlcNAc是單糖修飾并且易水解的特點，其糖基化位點的鑒定方法有待完善提高，本課題質譜分析獲得的5個潛在糖基化位點可能存在假陽性，需要使用其它方法確認在細胞內HK2的O-GlcNAc糖基化的真實位點，為此，我們分別構建了HK2O-GlcNAc糖基化修飾位點突變的真核表達載體，這5個HK2突變的表達載體分別為p3×FLAG-CMV-10/HK2/S32A、 p3×FLAG-C

6、MV-10/HK2/T331A、p3×FLAG-CMV-10/HK2/T336A、 p3×FLAG-CMV-10/HK2/S340A以及p3×FLAG-CMV-10/HK2/T762A，用脂質體Lipo fectamin2000將這樣的系列載體轉染至293T細胞，通過免疫共沉淀進一步確定在細胞內HK2的O-GlcNAc糖基化修飾的真正位點，目前實驗還在進行之中。
　　為了研究HK2糖基化位點的功能，需要獲得內源性HK2基因敲除的穩(wěn)

7、定細胞株。近幾年，隨著生物學的相關研究技術的發(fā)展，一種能夠對目的基因進行定點編輯改造的基因修飾技術--CRISPR/Cas9技術(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats/Cas9)為基因組的修飾提供了一種新的思路。CRISPR/Cas9技術是相比于鋅指核酸內切酶(zinc finger nucleases，ZFNs)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcrip

8、tion activatorl ike effector nuclease，Talens)技術更具有優(yōu)勢、操作更簡便更靈敏的第三代人工核酸內切酶技術。本研究采用CRISPR/Cas9技術對內源性HK2基因進行敲除，首先試驗設計了HK2-A、HK2-B和HK2-C共3組特異靶向HK2基因的靶位點，通過酶切連接的方法插入到CRISPR/Cas9骨架載體中并對其測序驗證，將構建的載體lentiC RISPRv2/HK2-A、lentiC RI

9、SPRv2/HK2-B和lentiC RISP Rv2/HK2-C分別轉染到細胞內，提取基因組DNA并對其進行PCR擴增目的片段，通過T7E1酶切實驗評估敲除的效率。結果表明靶向序列HK2-C具有較高的突變效率，然后使用含有靶向序列HK2-C的載體轉染細胞，運用有限稀釋和加藥篩選的方法獲得HK2基因敲除的穩(wěn)定MDA-MB-231細胞株，采用western blotting檢測方式對敲除效果進行了鑒定，確認獲得了2株HK2基因敲除的單克隆