1、MicroRNAs(miRNAs)是一類長度大約為22nt的非編碼小RNAs，它能通過靶向結(jié)合mRNA3'端非編碼區(qū)（3'UTR）調(diào)控大量生物學過程包括細胞增殖與凋亡、神經(jīng)元分化、腫瘤產(chǎn)生以及個體發(fā)育。本實驗室之前的研究通過比較C3H/HeJ和C57BL/6兩種近交系雌鼠間陰門開啟時間的差異定位到了與性發(fā)育相關(guān)的基因：miR-505。此外，有研究表明miR-29基因家族成員中的miR-29a在哺乳動物大腦中高度表達，并且隨著幼年個體生長

2、發(fā)育，其在大腦中的表達量有著明顯的波動，表明miR-29a可能在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用從而調(diào)控個體的生長發(fā)育。基因敲除技術(shù)是目前研究miRNA生物學功能的主要反向遺傳學方法之一。而CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)作為一種來源于細菌和古細菌免疫系統(tǒng)的新型基因編輯工具，能夠有效地引發(fā)靶基因突變進而導致基因功能喪失。
　　

3、目的：本研究嘗試利用miR-505基因敲除小鼠，研究miR-505敲除對雌鼠性發(fā)育和生殖力的影響；利用CRISPR-Cas9技術(shù)在GT1-7細胞中對miR-29a進行基因敲除，檢測miR-29a基因敲除GT1-7細胞的表型變化，探索miRNAs與性發(fā)育之間的聯(lián)系。
　　方法：在動物實驗方面，通過sgRNA/Cas9進行胚胎注射獲得miR-505基因修飾小鼠，通過與野生型C57BL/6小鼠三代回交得到穩(wěn)定遺傳的基因修飾小鼠。通過進一

4、步自交，獲得三種基因型的子代，最后比較不同基因型雌鼠miR-505表達量情況、性發(fā)育和生殖力表型。在細胞實驗方面，構(gòu)建C as9基因穩(wěn)轉(zhuǎn)的G T1-7細胞，并構(gòu)建sgRNA29a-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述GT1-7細胞，利用流式細胞儀富集陽性細胞和分選陽性單克隆細胞。最后對陽性單克隆細胞分別進行miR-29a表達量檢測、表型分析和靶基因預測與驗證。
　　結(jié)果：在動物實驗方面，胚胎注射獲得了16只miR-505基因工程小鼠，其中有兩只基

5、因工程小鼠分別具有17bp和23bp的堿基缺失。熒光定量PCR結(jié)果顯示，大片段缺失的基因工程小鼠的miR-505表達量有了顯著的下降。雖然不同基因型雌鼠間miR-505表達量的顯著差異沒有引起性發(fā)育和生殖能力的統(tǒng)計學顯著性變化，但是總體平均值顯示雌鼠miR-505表達的缺失具有使陰門開啟時間提前和增強部分生殖指標的趨勢。在細胞實驗方面，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達C as9蛋白的GT1-7細胞模型，并利用該細胞模型完成了多種基因編輯。此外，流式富

6、集后的表達綠色熒光蛋白陽性GT1-7細胞，其miR-29a突變率和表達量都發(fā)生了明顯的變化。通過流式細胞儀獲得了一個miR-29 a基因修飾GT1-7單克隆細胞，它在miR-29a基因區(qū)段有2 bp的堿基缺失。此外，miR-29a的表達量下降程度較富集細胞更高，而且miR-29a表達量的顯著下降導致了GT1-7細胞生長速率的減緩和表型的變化。靶基因驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DCX基因受到了miR-29a表達量變化的影響。
　　結(jié)論：利用CRI

7、PSR-Cas9系統(tǒng)對miRNAs基因進行編輯能夠有效降低miRNAs的表達量，即使CRISPR-Cas9系統(tǒng)造成的堿基缺失主要發(fā)生在miRNAs的加工區(qū)域。而Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)GT1-7細胞顯著提高了基因編輯效率，并有利于后續(xù)利用流式細胞儀進行富集細胞。通過構(gòu)建miR-505基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)，miR-505敲除對雌鼠性發(fā)育和生殖能力沒有產(chǎn)生統(tǒng)計學顯著的影響，但是總體平均值顯示miR-505敲除雌鼠陰門開啟的時間和部分生殖指標具有一致性的