1、大豆作為世界上最為重要的一種經(jīng)濟(jì)作物，每年在各個(gè)國(guó)家都有大宗的貿(mào)易份額，在其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到多種真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)等病原物的侵染。菜豆莢斑駁病毒(Beanpodmottlevirus，BPMV)、煙草環(huán)斑病毒(Tobaccoringspotvirus，TRSV)和番茄環(huán)斑病毒(Tomatoringspotvirus，ToRSV)均是危害大豆的重要病毒，也是我國(guó)的主要檢疫對(duì)象，建立其多重PCR的快速檢測(cè)體系，提高病毒的檢測(cè)效率，

2、為快驗(yàn)快放服務(wù)。
　　 本研究以帶有BPMV、TRSV和ToRSV的大豆種子為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)BPMV、TRSV、ToRSV的CP基因設(shè)計(jì)合成多對(duì)引物，然后進(jìn)行單基因PCR反應(yīng)特異性驗(yàn)證，同時(shí)選擇大豆內(nèi)源基因(BD30K)作為參照物，確保RNA提取、cDNA第一鏈合成及PCR等過(guò)程被正確操作，防止假陰性結(jié)果的發(fā)生。在此基礎(chǔ)上合理組合各對(duì)引物并調(diào)整、優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件，最終確立了四對(duì)特異性引物和多重PCR的反應(yīng)條件，選用的引物分

3、別可擴(kuò)增BPMV275bp，TRSV580bp，ToRSV794bp，BD30K104bp的特異性片段，反應(yīng)條件則在普通PCR的基礎(chǔ)上調(diào)整反應(yīng)緩沖液濃度至1.4X，BD30K的引物濃度為其他引物的2倍，在此條件下我們建立了同時(shí)檢測(cè)大豆種子中BPMV、TRSV、ToRSV及大豆內(nèi)源基因BD30K的多重RT-PCR體系。
　　 研究結(jié)果表明，同步檢測(cè)的特異性和靈敏度均好；能夠檢測(cè)到BPMV、TRSV、ToRSV和BD30K的RNA最

4、低含量分別為0.9ng、0.186ng、8.0pg、3.8ng；攜帶三種病毒的大豆種子混合后提取的RNA的最低檢測(cè)含量為1.16ng。表明建立的多重PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，可操作性強(qiáng)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作步驟，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值，適合口岸對(duì)進(jìn)境大豆種子中這3種病毒的快速檢測(cè)，在出入境檢驗(yàn)檢疫中具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 本研究還建立了大豆種子中BPMV和TRSV單管雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。將含有相同濃度的

5、分別帶有BPMV和TRSVCP基因的質(zhì)粒溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，以受2種病毒侵染的大豆種子作為實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果表明能從同一管中同時(shí)檢測(cè)出這兩種病毒而不發(fā)生交叉反應(yīng)。盡管在陽(yáng)性對(duì)照中，二者的檢測(cè)限相當(dāng)，均可達(dá)到35pg/mL，但在實(shí)際應(yīng)用中，兩種病毒由于在大豆種子中的濃度不一致而存在一定的差別。同時(shí)將實(shí)時(shí)熒光靈敏度與DAS-ELISA和RT-PCR檢測(cè)靈敏度進(jìn)行比較，結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)BPMV和TRSV的靈敏度分別是