1、長(zhǎng)期以來(lái)，由于其宿主特異性，桿狀病毒載體僅限于在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的重組桿狀病毒能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞并且可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)外源蛋白。由于其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、易操作、增殖滴度高、易擴(kuò)增、載體容載量大、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不復(fù)制和生物安全性好等優(yōu)點(diǎn)，重組桿狀病毒有望成為良好的基因治療載體。
　　 Apoptin是一種來(lái)源于雞貧血病毒的小蛋白，能特異性誘導(dǎo)大量的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，而

2、對(duì)正常二倍體細(xì)胞無(wú)凋亡誘導(dǎo)作用。特異的腫瘤細(xì)胞殺傷性使Apoptin成為癌癥基因治療的一種新的工具。
　　 Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne musculardystrophy，DMD）是一種以骨骼肌進(jìn)行性變性、壞死為主要病理特征的致死性X-性連鎖隱性遺傳性肌病，目前尚無(wú)有效的治療方法，基因治療被認(rèn)為是治療該病最有希望的途徑。但是現(xiàn)有的基因治療載體的載體容載量少、需要復(fù)制輔助病毒和存在著生物安全性等局限性大大的限

3、制它的臨床應(yīng)用。因此提高治療基因在體內(nèi)的表達(dá)效率以及選擇合適的載體將是治療DMD獲得成功的關(guān)鍵。
　　 鑒于上述的研究背景，本研究探討了含有Apoptin蛋白的重組桿狀病毒在體外、體內(nèi)的抑瘤的作用；研究了含有microdystrophin蛋白的重組桿狀病毒在體內(nèi)和體外的microdystrophin表達(dá)情況，比較了重組桿狀病毒和重組腺病毒在體內(nèi)基因治療mdx鼠的效果。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1．重組桿狀病毒BV-Apo

4、ptin的構(gòu)建
　　 從質(zhì)粒pVAX-Apoptin中PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)的Apoptin片段，經(jīng)酶切克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HisB中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-His-Apoptin。然后將CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼Apoptin蛋白的整個(gè)讀碼框插入轉(zhuǎn)移載體pFast-VSV-G中VSV-G的下游，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFast-G-Apoptin。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌，通過(guò)藍(lán)白斑菌落及抗性篩選，獲得重組穿梭

5、載體Bacmid-Apoptin，提取其基因組并轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒BV-Apoptin。
　　 2．重組桿狀病毒BV-Apoptin的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)研究
　　 重組桿狀病毒BV-Apoptin在細(xì)胞中有正確的定位。在人肝癌細(xì)胞HepG2中Apoptin主要定位于細(xì)胞核，在人胚腎細(xì)胞HEK-293中，Apoptin定位于細(xì)胞質(zhì)中。體外轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)表明，構(gòu)建的重組桿狀病毒BV-Apoptin能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)HepG2細(xì)胞，

6、Apoptin的表達(dá)水平與桿狀病毒的感染劑量成正相關(guān)，當(dāng)感染復(fù)數(shù)越高，表達(dá)Apoptin蛋白的細(xì)胞數(shù)越多。
　　 3．重組桿狀病毒BV-Apoptin在體外、體內(nèi)的抑瘤作用
　　 將重組桿狀病毒BV-Apoptin分別以不同感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)HepG2細(xì)胞，通過(guò)DNA-Ladder和TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，重組桿狀病毒BV-Apoptin能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞HepG2的產(chǎn)生凋亡，并且BV-Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)

7、胞凋亡的能力呈劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)利用異體同源腫瘤細(xì)胞系移植的方法復(fù)制了C57BL/6小鼠荷H22腫瘤模型，研究構(gòu)建的重組桿狀病毒BV-Apoptin的體內(nèi)抑瘤效果。結(jié)果顯示，注射BV-Apoptin能夠明顯抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)也提高荷瘤小鼠的存活率。以上結(jié)果提示，重組桿狀病毒BV-Apoptin有望成為治療腫瘤的一種新的有效手段。
　　 4．重組桿狀病毒BV-MICDYS的構(gòu)建
　　 從載體pcDNA3.1（+）中酶切

8、CMV啟動(dòng)子的表達(dá)框，插入轉(zhuǎn)移載體pFast-VSV-G中VSV-G的下游，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFast-G-CMV；然后從質(zhì)粒pBSK-MICRO酶切全長(zhǎng)的microdystrophin基因，分別克隆到pFast-G-CMV中，構(gòu)建質(zhì)粒pFast-G-MICDYS。轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌，通過(guò)藍(lán)白斑菌落及抗性篩選，獲得重組穿梭載體Bacmid-MICDYS，提取其基因組并轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒BV-MICDYS。
　

9、　 5．重組桿狀病毒BV-MICDYS轉(zhuǎn)導(dǎo)C2C12細(xì)胞
　　 將構(gòu)建的重組桿狀病毒BV-MICDYS以不同的感染復(fù)數(shù)（50、100、200MOI）轉(zhuǎn)導(dǎo)C2C12細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后48h檢測(cè)microdystrophin基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，重組桿狀病毒BV-MICDYS能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)C2C12細(xì)胞，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。結(jié)果還顯示，相同感染復(fù)數(shù)的Ad-MICDYS感染的C2C12細(xì)胞中microdystrophin蛋白表達(dá)數(shù)量低于相同

10、感染復(fù)數(shù)BV-MICDYS轉(zhuǎn)導(dǎo)的C2C12細(xì)胞中microdystrophin蛋白表達(dá)數(shù)量，說(shuō)明了在C2C12細(xì)胞中，桿狀病毒有著比腺病毒更高的靶基因表達(dá)水平的能力。
　　 6．體內(nèi)研究重組桿狀病毒BV-MICDYS在mdx TA中的轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　 將重組桿狀病毒BV-MICDYS分別以不同的劑量（1010pfu/mL，109pfu/mL，108pfu/mL）注射到mdx TA，2周和8周后做肌肉組織冰凍切片，HE檢測(cè)肌肉病