1、喜樹堿(Camptothecin,CPT)由于高效、廣譜的抗腫瘤活性而位居癌癥治療前列,但明顯的毒副作用限制了它在臨床上的使用,因而開發(fā)抗腫瘤活性強、毒副作用小的衍生物成為了國內外研究熱點。9-甲氧基喜樹堿(9-Methoxycamptothecin,MCPT),一種喜樹堿衍生物,體內外試驗均證實有明顯的抗多種腫瘤活性,但對其有關細胞和分子方面的機制研究極少。本課題首先體外評價了9-甲氧基喜樹堿的抗腫瘤細胞活性,并從9-甲氧基喜樹堿誘導

2、腫瘤細胞凋亡、影響DNA拓撲異構酶活性及其與DNA分子相互作用等三個方面進行了作用機制的研究。
　　1.評價9-甲氧基喜樹堿體外抗腫瘤活性。結果表明,9-甲氧基喜樹堿抑制7種腫瘤細胞系,呈劑量依賴性。其中,人卵巢癌細胞A2780和人宮頸癌細胞Hela對9-甲氧基喜樹堿最為敏感,其IC50值分別為79±21nM和151±61nM,明顯低于陽性對照藥物10-羥基喜樹堿(Hydroxycamptothecin,HCPT)。選取這兩種細胞

3、系開展后續(xù)作用機制研究。
　　2.研究了9-甲氧基喜樹堿誘導細胞凋亡作用及其機制。結果表明:(1)9-甲氧基喜樹堿處理A2780和Hela細胞后,熒光顯微鏡下觀察到誘導的凋亡細胞,流式細胞儀檢測到明顯的早期和晚期凋亡細胞。9-甲氧基喜樹堿誘導A2780細胞的早期凋亡和總凋亡率增加具有時間-劑量依賴性;(2)9-甲氧基喜樹堿處理A2780和Hela細胞24h后即表現(xiàn)出強的G2/M期阻滯。1×IC50濃度的9-甲氧基喜樹堿處理A278

4、0細胞24h后對G2/M期阻滯最明顯,達到81.93％;(3)9-甲氧基喜樹堿能使A2780和Hela細胞中產生活性氧(ROS)明顯增多。A2780細胞中ROS產生量最高達到對照組的5.22倍,Hela細胞中最高為2.65倍;(4)9-甲氧基喜樹堿能不同程度激活caspase-3,-8和-9。在A2780細胞中對caspase-9酶激活程度最強,是對照組細胞的15倍。Hela細胞中caspase-3的酶活性被顯著提高,約為對照組細胞的8

5、倍;(5)實時定量PCR檢測到9-甲氧基喜樹堿調節(jié)了17個內、外源性細胞凋亡通路及細胞周期相關基因。其中對細胞周期調控基因p21,p27和cyclinE上調較顯著;且明顯上調參與外源性細胞凋亡通路的TNFα、Fas和FasL;同時還調節(jié)了主要參與內源性細胞凋亡通路的bcl-2家族有關基因表達水平;(6)Westernblot檢測到TNFα,Fas,P53和P27的蛋白表達水平上調,與其基因水平調節(jié)一致。綜上所述,9-甲氧基喜樹堿可通過調

6、節(jié)細胞周期調控蛋白使細胞周期阻滯于G2/M期,并增加ROS的產生、調節(jié)bcl-2家族相關基因激活caspase-9,從而啟動內源性細胞凋亡通路;同時激活了caspase-8啟動以TNFα和Fas/FasL為主的外源性細胞凋亡通路。以上兩條通路共同激活caspase-3,最終導致A2780和Hela細胞凋亡。
　　3.研究了9-甲氧基喜樹堿對DNA拓撲異構酶Ⅰ和Ⅱ活性的影響。結果顯示,100μM的9-甲氧基喜樹堿表現(xiàn)出對拓撲異構酶Ⅰ

7、明顯的抑制作用,與陽性對照藥物喜樹堿一樣,可使超螺旋DNA產生明顯的缺刻型DNA條帶。不同濃度的9-甲氧基喜樹堿均未表現(xiàn)出對拓撲異構酶Ⅱ的抑制作用(與陽性對照藥物依托泊苷相比)。值得注意的是,100μM的9-甲氧基喜樹堿能單獨作用于超螺旋DNA并產生明顯的缺刻型DNA產物,表明9-甲氧基喜樹堿在沒有拓撲異構酶Ⅰ存在的情況下也能作用于DNA。提示,9-甲氧基喜樹堿的這種直接結合DNA的能力很有可能是其抗腫瘤活性強的一種重要機制。
　

8、　4.采用光譜法研究了9-甲氧基喜樹堿與DNA分子相互作用。結果表明,(1)紫外-可見吸收光譜顯示,隨著不斷滴加CT-DNA,9-甲氧基喜樹堿最大吸收峰出現(xiàn)了增色效應,譜帶未發(fā)生偏移,表明其與DNA的作用屬于外部鍵合模式(溝槽作用和/或靜電作用)。9-甲氧基喜樹堿處理CT-DNA前后體系的解鏈溫度(meltingtemperature,Tm)值升高不明顯,也支持外部鍵合模式;(2)熒光光譜顯示,隨著CT-DNA濃度不斷增加,9-甲氧基喜

9、樹堿熒光強度不斷增強,沒有發(fā)生明顯光譜偏移現(xiàn)象,支持外部鍵合模式;(3)9-甲氧基喜樹堿與CT-DNA相互作用的圓二色譜顯示,9-甲氧基喜樹堿加入后,體系的正峰有小的提升,而其負峰有較明顯的回落并伴有輕微的吸收峰紅移現(xiàn)象。由于負峰變化程度大于正峰,表明兩者結合以溝槽模式為主。綜上可知,9-甲氧基喜樹堿與CT-DNA的結合方式以溝槽模式為主。
　　綜合以上研究結果表明,9-甲氧基喜樹堿具有明顯的抗多種腫瘤細胞活性,其作用機制主要是通