1、蛋白質(zhì)混合物的高效分離對(duì)蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)組的定性和定量分析及應(yīng)用具有重要意義，但由于蛋白質(zhì)種類多，動(dòng)態(tài)范圍寬，其分離和制備面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)中常用的蛋白質(zhì)混合物高效分離技術(shù)主要包括高效液相色譜和電泳技術(shù)。電泳技術(shù)相較于高效液相色譜，其優(yōu)勢(shì)是分離度高，并且可以得到等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量信息，其劣勢(shì)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，自動(dòng)化程度低，且難以用于蛋白質(zhì)的制備。制備電泳技術(shù)是在制備電泳裝置中對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分離、純化和收集制備的一種技術(shù)。在過(guò)去的

2、幾十年里，制備電泳技術(shù)和制備型電泳裝置取得了很大的進(jìn)展，其制備量也從毫克級(jí)的蛋白質(zhì)逐漸減少到微克級(jí)的蛋白質(zhì)，可滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究需求?，F(xiàn)已商品化的制備型電泳裝置分為毫克級(jí)制備型電泳裝置和微克級(jí)制備型電泳裝置。毫克級(jí)制備型電泳裝置多為早期的裝置，其不足是樣品分離和收集的耗時(shí)很長(zhǎng)（通常在10 h以上），回收率低，收集的過(guò)程中需不斷補(bǔ)充洗脫液，實(shí)驗(yàn)過(guò)程較為繁瑣，且只能用于毫克級(jí)以上的蛋白質(zhì)樣品的制備；近年來(lái)，微克級(jí)制備型電泳裝置的發(fā)展較為迅速

3、，但也存在諸如實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣、樣品分離度不夠高等問(wèn)題。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)制作了一套微量級(jí)制備型凝膠電泳裝置，用于實(shí)驗(yàn)室的微量級(jí)快速、簡(jiǎn)便的蛋白質(zhì)分離與制備，其制備過(guò)程為：首先將微克級(jí)的蛋白質(zhì)按照分子量大小進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移凝膠至洗脫收集裝置中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫收集。對(duì)此套制備型凝膠電泳裝置的性能測(cè)試結(jié)果表明，該裝置可以簡(jiǎn)便、高效、高回收率地完成蛋白質(zhì)樣品的分離制備。
　　本論文由三章組成。第一章介紹了現(xiàn)有的分離分析技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的發(fā)展

4、與現(xiàn)狀，尤其是對(duì)制備型電泳方法與技術(shù)做了詳細(xì)的概述。同時(shí)，第一章還包括本研究的內(nèi)容、所要解決的具體問(wèn)題以及研究意義。
　　在第二章，介紹了我們?cè)O(shè)計(jì)并制作的一套制備型凝膠電泳與紫外檢測(cè)聯(lián)用裝置。該裝置通過(guò)將改進(jìn)的平板凝膠電泳裝置與外部氣體壓縮泵、高壓儲(chǔ)液罐、紫外檢測(cè)器、電腦以及餾分收集器相連，實(shí)現(xiàn)了在線完成蛋白樣品組分的分離、檢測(cè)與回收的目標(biāo)。在對(duì)裝置的性能測(cè)試與評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，采用馬心肌紅蛋白和牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物，考察了該

5、裝置分離性能，紫外吸收光譜結(jié)果表明成功分離了這兩個(gè)蛋白。盡管如此，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)該裝置存在有許多問(wèn)題：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，裝置漏液現(xiàn)象嚴(yán)重，正極處產(chǎn)生氣泡現(xiàn)象對(duì)檢測(cè)和收集產(chǎn)生影響，而且裝置在加工中成型慢，加工周期長(zhǎng)，這些都是我們進(jìn)一步改進(jìn)備型凝膠電泳設(shè)計(jì)時(shí)需要解決的問(wèn)題。
　　在第三章，介紹了在制備型凝膠電泳與紫外檢測(cè)聯(lián)用裝置基礎(chǔ)上的一種新型制備型凝膠電泳裝置。為了解決制備型凝膠電泳與紫外檢測(cè)聯(lián)用裝置存在的諸多問(wèn)題，我們將裝置

6、由在線檢測(cè)改為了離線檢測(cè)，并基于3D打印技術(shù)和數(shù)字控制加工技術(shù)，設(shè)計(jì)了制作簡(jiǎn)單，成型快，周期短，精度高的制備型凝膠電泳分離-洗脫聯(lián)用裝置。按照蛋白質(zhì)分離與洗脫方向的不同，可分為橫向洗脫和垂直洗脫制備型凝膠電泳分離-洗脫聯(lián)用兩種裝置。通過(guò)對(duì)設(shè)計(jì)制作的制備型凝膠電泳分離-洗脫聯(lián)用裝置的機(jī)械強(qiáng)度、防漏液與操作性能測(cè)試，對(duì)符合要求的裝置進(jìn)一步進(jìn)行了蛋白樣本分離、洗脫回收、分離度、回收率、洗脫時(shí)間以及洗脫樣本的液相色譜-質(zhì)譜分析等測(cè)試。在優(yōu)化設(shè)計(jì)

7、和性能測(cè)試的基礎(chǔ)上，確定定型的制備型凝膠電泳裝置為垂直洗脫的制備型凝膠電泳分離-洗脫聯(lián)用裝置。蛋白混合物分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明制備型凝膠電泳分離裝置不僅能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)樣本進(jìn)行高效分離，而且具有高的重復(fù)性；在采用制備型凝膠電泳洗脫裝置進(jìn)行的洗脫實(shí)驗(yàn)中，由于蛋白樣本垂直于凝膠厚度方向洗脫，因此，在最佳洗脫條件下，洗脫時(shí)間少于20分鐘，碳酸酐酶的回收率高達(dá)91.8％，實(shí)現(xiàn)了快速、高回收率的洗脫，優(yōu)于同類型的商品化的制備型凝膠電泳裝置。將垂直洗脫的制備

8、型凝膠電泳分離-洗脫聯(lián)用裝置用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物以及酵母全蛋白的分離與制備，其分離度和分離效率均優(yōu)于商品化的制備型凝膠電泳裝置。將該裝置作為預(yù)分離手段，與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，對(duì)10μg的牛血清白蛋白進(jìn)行分離、洗脫后進(jìn)行FASP（ filter aided proteome preparation）酶解與經(jīng)過(guò)該分離裝置分離后進(jìn)行膠內(nèi)酶解做了對(duì)比，結(jié)果表明，經(jīng)該裝置分離、洗脫和FASP酶解的方法最多鑒定到94個(gè)特異性肽段，平均蛋白質(zhì)序列覆蓋率

9、為90.12%；經(jīng)該分離裝置分離后進(jìn)行膠內(nèi)酶解，最多鑒定到70個(gè)特異性肽段，平均蛋白質(zhì)序列覆蓋率為86%。同樣地，我們對(duì)20μg的酵母蛋白提取物也做了上述對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，相同條件下使用該裝置分離、洗脫和FASP酶解的方法鑒定到的肽段數(shù)目、序列覆蓋率大于50%的蛋白數(shù)目以及打分值大于1000的蛋白數(shù)目均遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于利用該裝置分離后進(jìn)行膠內(nèi)酶解所鑒定到的相應(yīng)的肽段數(shù)目和蛋白數(shù)目。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明使用該裝置進(jìn)行分離、洗脫后進(jìn)行FASP酶解的方法更