1、延胡索酸水合酶，又稱延胡索酸酶(fumarate hydratase，E.C4.2.1.2)，是催化延胡索酸轉變成L-蘋果酸的-類酶。L-蘋果酸在食品、醫(yī)藥、印染和建筑等行業(yè)上有特殊的用途。近幾年來具有高度耐熱活性產延胡索酸酶微生物，如黃色短桿菌(Brevibacteium Flavum)及短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，被廣泛應用于以延胡索酸作底物生產L-蘋果酸。但是目前天然發(fā)酵菌種在工業(yè)生產中存在著延胡索酸水合酶

2、活力不高或者受天冬氨酸轉氨酶干擾的難題。宏基因組學技術繞開了“純培養(yǎng)”的技術瓶頸，使得人們在基因組水平上直接開發(fā)利用各種環(huán)境中豐富的微生物基因資源成為現實。本實驗室利用宏基因文庫技術，構建了廣西北部灣海洋沉積物文庫。利用活性篩選和直接測序相結合的篩選策略，得到了一種編碼延胡索酸水合酶的新型酶基因(fumF)。生物信息學分析結果表明，在氨基酸水平上和一種來自于Burkholderia（伯克氏菌）菌屬的延胡索酸水合酶同源性為27％，一致性為

3、41％。利用PCR定點擴增技術擴增目的基因，與表達質粒pETBlue-2連接，導入表達宿主細胞BL21(DE3)pLysS，構建了重組表達克隆pGXAM3566G/BL21(DE3)pLysS。SDS-PAGE蛋白電泳結果表明，目標誘導蛋白大小為60kDa左右，與生物信息學分析結果基本一致。本工作為進一步研究新型延胡索酸水合酶FumF的生化功能奠定了基礎。
　　 本研究以大腸桿菌表達菌株pGXAM3566G/BL21(DE3)p

4、LysS的表達fumF編碼的基因產物主要研究對象，對其進行了酶學性質的初步研究，發(fā)現正向反應最適pH值8.5，最適作用溫度55℃的條件下，逆向反應受pH值及溫度影響比較小。以延胡索酸及蘋果酸分別作為底物，得出FumF重組蛋白的酶活為6.75U/mg，逆反應方向酶活為0.68U/mg。測定正向反應的Km值為0.5228 mM，最大反應速度為54μM/min，轉換數Kcat為9.085 min-l，反相反應Km值為4.33 mM，最大反應速