1、蛋白質藥物因其具有高活性、特異性強和生物功能明確等特點使其應用日益廣泛，但蛋白質的不穩(wěn)定性使其在儲存或運輸過程中常出現(xiàn)脫酰胺降解、二硫鍵錯配以及聚集形成沉淀等現(xiàn)象，造成蛋白質的活性損失甚至產(chǎn)生一定的副作用，降低了其臨床使用效果。本文以重組人血管內皮抑制素和重組人粒細胞集落刺激因子為模型蛋白，利用液相色譜質譜聯(lián)用技術結合蛋白質酶解技術研究了蛋白質儲存過程中發(fā)生的脫酰胺過程及二硫鍵變化，繼而對二者進行PEG修飾，重點考察PEG修飾對蛋白質儲

2、存過程中脫酰胺與二硫鍵的影響。
　　 本文從三個方面對藥用蛋白質的儲存穩(wěn)定性開展了研究探索。首先，系統(tǒng)研究了重組人血管內皮抑制素在不同儲存條件下天冬酰胺的脫酰胺變化，結果表明該蛋白序列中與Gly相連的Asn127在儲存過程發(fā)生了脫酰胺反應，實驗研究不同條件下Asn127脫酰胺過程的動力學并系統(tǒng)考察了不同pH和溫度下脫酰胺過程動力學參數(shù)，結果表明在實驗選擇的條件下脫酰胺過程隨pH與溫度的升高，反應速率加快。
　　 其次，研

3、究了重組人粒細胞集落刺激因子中的二硫鍵連接方式及其對蛋白質穩(wěn)定性的影響，蛋白酶解產(chǎn)物中檢測出分子間二硫鍵Cys18-Cys18及錯配的二硫鍵Cys18-Cys37、Cys18-Cys65或Cys37-Cys75。蛋白濃度從0.5 mg/mL增加到1.0 mg/mL、1.52 mg/mL，分子間二硫鍵Cys18-Cys18的含量在其濃度基礎上依次增加15.25％、105.08％，表明分子間二硫鍵在一定范圍內受濃度影響，濃度增加可加劇其形成

4、過程。檢測出含分子間二硫鍵的多肽(MW15710 Da)，該多肽含量隨濃度的增加減少且該過程伴隨沉淀產(chǎn)生，證明了蛋白質沉淀過程與分子間二硫鍵形成密切相關。
　　 第三部分主要研究了PEG修飾對蛋白質脫酰胺過程和二硫鍵的影響。采用mPEG-ALD(20 kDa)對原蛋白進行修飾，利用蛋白質酶解技術結合多級質譜技術研究了修飾前后多肽含量的變化并確定修飾位點；研究了PEG修飾對脫酰胺及二硫鍵的影響，考察了脫酰胺速率常數(shù)，結果表明修飾后