1、胰島素是FDA批準的第一個用于人類的基因重組藥物。最初的重組表達是通過大腸桿菌分別表達出胰島素的A鏈和B鏈?，F(xiàn)在,胰島素作為重組蛋白產(chǎn)品,主要有兩條途徑獲得。一條途徑是在大腸桿菌中表達胰島素前體的包涵體,通過溶解和復性等過程獲得胰島素。另外一條途徑是通過酵母表達系統(tǒng),分泌表達可溶性的胰島素前體進入培養(yǎng)液。由于對釀酒酵母大規(guī)模培養(yǎng)有豐富的經(jīng)驗,使其成為了第一個分泌表達胰島素前體的酵母系統(tǒng)。雖然釀酒酵母仍然是主要的胰島素產(chǎn)品表達系統(tǒng),近些年

2、幾個備選的表達系統(tǒng)也提供了可能性。其中,畢赤酵母是一種非常有用并且優(yōu)勢明顯的表達宿主。尤其是它強有力的醇氧化酶(Alcoholoxidase,AOX)啟動子,受甲醇嚴格誘導調控,通過簡單培養(yǎng)可以達到較高的細胞密度,能夠穩(wěn)定且高水平表達外源蛋白。
　　研究目的:構建含短C肽AAK的人胰島素原類似物DesB30(HMPIDesB30 Human Mini-proinsulin DesB30)的畢赤酵母表達系統(tǒng),即 pPIC9K- HM

3、PIDesB30/ GS115、pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115、pPIC9K-pGAPZαA- HMPIDesB30/GS115,通過搖瓶實驗篩選出表達量高的工程菌株 FJ-H1、FJ-H2、 FJ-H3。優(yōu)化發(fā)酵條件,考察不同啟動子對重組畢赤酵母高密度表達人胰島素前體的影響。
　　研究方法:構建重組質粒pGAPZαA-HMPIDesB30和pPIC9K-HMPIDesB30。分別用AvrII酶和SacⅠ酶線性化

4、pGAPZαA-HMPIDesB30和pPIC9K-HMPIDesB30并電轉化畢赤酵母菌株 GS115。利用含不同濃度 Zeocin或G418的平板篩選獲得多拷貝重組工程菌 pGAPZαA- HMPIDesB30/GS115和pPIC9K- HMPIDesB30/GS115。將重組質粒pGAPZαA-HMPIDesB30,經(jīng)AvrII酶單酶切線性化后,電轉化至經(jīng)質粒 pPIC9K- HMPIDesB30異位整合的胰島素原分泌菌株 pP

5、IC9K-HMPIDesB30/GS115,獲得工程菌株pPIC9K-pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115。分別進行搖瓶表達HMPIDesB30并篩選高表達菌株FJ-H1(pPIC9K-HMPIDesB30/GS115)、FJ-H2(pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115)、 FJ-H3(pPIC9K-pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115),進行發(fā)酵工藝的研究。
　　研究結果:FJ-H3菌株的表達

6、量最高,可達到1.6 g/L,分別為FJ-H1(1.0 g/L)的1.6倍和FJ-H2(0.3 g/L)的5.3倍。說明應用AOX1和GAP雙啟動子共表達體系能夠提高人胰島素原在畢赤酵母中的表達量。將FJ-H3表達的胰島素前體純化和酶切回收,通過12％Tricine SDS-PAGE、質譜和肽圖分析出HMPIDesB30的分子量與理論分子量相符,FJ-H3表達的目的蛋白均一、正確。
　　結論:本研究實現(xiàn)了含短C肽的人胰島素原類似物