1、　　人胰島素樣生長因子Ⅱ(insulin-like growth factor Ⅱ,IGF-Ⅱ)是一種重要的胎兒生長因子及有絲分裂原,其基因定位于染色體11p15.5,內(nèi)含9個(gè)外顯子(E1~E9)和4個(gè)不同的啟動(dòng)子(P1~P4)。E7、E8的全部和E9的第一部分編碼IGF-Ⅱ前體蛋白；E1~E6 6個(gè)外顯子為非翻譯序列,位于該基因的5′端,其中E1、E4、E5和E6之前分別有一個(gè)不同的啟動(dòng)子(P1~P4),總共編碼五種5′端非翻譯區(qū)不同

2、的IGF-ⅡmRNA,但其成熟蛋白產(chǎn)物(67肽)卻相同。在生長發(fā)育過程中,4個(gè)啟動(dòng)子不同的生物活性,具有組織特異性和發(fā)育階段獨(dú)立性表達(dá)特征。在胎肝和新生兒肝,IGF-ⅡmRNA表達(dá)量最高,其中P3活性最大(大約占70%),其次分別為P4及P2,P1失活；在成人肝臟,IGF-ⅡmRNA表達(dá)量顯著下調(diào),約為新生兒峰值的1/10,其中P1活性最大(約占50%),依次為P4、P2及P3,約70%成人肝臟P3呈關(guān)閉狀態(tài),僅30%成人呈微量表達(dá)。<

3、br>　　近年研究發(fā)現(xiàn),人IGF-Ⅱ在肝細(xì)胞癌變過程中呈過量表達(dá)狀態(tài),而且是癌變的早期改變事件。異常表達(dá)的IGF-Ⅱ通過自分泌和/或旁分泌生長調(diào)控機(jī)制直接作用于自身和/或鄰近肝細(xì)胞膜上的IGF-Ⅰ受體,促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期,加速DNA和蛋白質(zhì)等的合成,導(dǎo)致肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。目前認(rèn)為,IGF-Ⅱ的過表達(dá)與P3、P4胚胎型啟動(dòng)子再活化及成人型啟動(dòng)子P1失活關(guān)系密切,但P3、P4再活化和P1失活的原因及調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。暨南大學(xué)博士學(xué)位

4、論文摘要
　　為此,本研究選擇已知IGF一11基因無異常的L一02人胎肝細(xì)胞系作為正常對(duì)照克隆該基因的P1一P4啟動(dòng)子片段,并以此為基礎(chǔ),觀察肝癌中IGF一11基因啟動(dòng)子堿基序列有無改變、甲基化水平變化及其與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系,檢測IGF一n基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性,分析啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)元件及其與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用,以揭示肝癌中IGF一H基因各啟動(dòng)子活性改變的可能機(jī)制及其與IGF一11過表達(dá)的關(guān)系。第一部分人工GF一n基因P1一P4啟動(dòng)子

5、克隆及序列分析
　　目的：克隆人IGF一n基因Pl一P4啟動(dòng)子并進(jìn)行序列分析,以明確肝癌組織中工GF一11基因啟動(dòng)子堿基序列有無改變及其與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的工GF一11基因DNA全序列及參考有關(guān)文獻(xiàn),應(yīng)用巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增分離L一02人胎肝細(xì)胞系(正常對(duì)照)及8例肝癌組織的IGF一11基因Pl一P4啟動(dòng)子片段,并采用TOPO TA Cloning kit將PCR產(chǎn)物

6、克隆入pCR2.1一TOPOT載體。目的DNA片段和陽性重組子分別通過瓊脂糖凝膠電泳及直接測序鑒定。
　　結(jié)果：①L一02細(xì)胞及8例肝癌組織P1一P4啟動(dòng)子目的DNA片段均擴(kuò)增成功,長度分別為942bp、684bp、1425bp及1246bp；②8例肝癌組織Pl~P4啟動(dòng)子片段的堿基序列與L一02相應(yīng)的DNA序列完全相同,未見突變、缺失等改變,經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫(NT』09308)相比較,結(jié)果完全一致。
　　結(jié)論：①成

7、功克隆了IGF一11基因Pl一P4啟動(dòng)子；②本組肝癌組織中IGF-11基因啟動(dòng)子DNA序列穩(wěn)定,未見突變、缺失等改變,可能與IGF一11異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制無關(guān)。第二部分人肝癌IGF一n基因Pl~P4啟動(dòng)子甲基化研究目的：探討肝癌中IGF一n基因P1~P4啟動(dòng)子甲基化水平變化及其對(duì)轉(zhuǎn)錄活暨南大學(xué)博士學(xué)位論文摘要性的影響。
　　方法：應(yīng)用PC尺甲基化分析法及半定量RT一PCR分別檢測肝癌細(xì)胞系(H即G2、SMMC一7721和Bel

8、一7402)、8例肝癌組織及配對(duì)的癌旁肝組織、7例正常成人肝組織中IGF一H基因Pl一P4啟動(dòng)子的甲基化及其mRNA表達(dá)狀況。
　　結(jié)果：①正常成人肝組、肝癌組(包括3個(gè)肝癌細(xì)胞系,下同)和癌旁肝組Pl啟動(dòng)子的甲基化率分別為14.30k(1/7)、81.8%(9/ll)和75.0%(6/8),P2啟動(dòng)子的甲基化率分別為42.9%(3/7)、36.4%(4/11)和25.0%(2/6),P3啟動(dòng)子的甲基化率分別為71.4ry0(5/

9、7)、0.0%和12.50k(1/8),P4啟動(dòng)子的甲基化率分別為71.4%(5/7)、0.0%和0.0%。肝癌組和癌旁肝組Pl啟動(dòng)子的甲基化率明顯高于正常成人肝組(P<；0.05),而P3和P4啟動(dòng)子的甲基化率則都明顯低于正常成人肝組(P<；0.01,P<；0.05),P2啟動(dòng)子的甲基化率在3組間無顯著性差異(P>；0.05)。②正常成人肝組、肝癌組和癌旁肝組PI mRNA的表達(dá)量分別為0.27士0.034、0.05士

10、0.028和0.09士0.040,PZ mRNA的表達(dá)量分別為0.10士0.034、0.11土0.029和0.15士0.034,P3 mRNA的表達(dá)量分別為0.04士0.027、2.20士0.427和2.99士0.654,P4 mRNA的表達(dá)量分別為0.06士0.029、0.76士0.090和1.35士0.226。肝癌組和癌旁肝組PI mRNA的表達(dá)水平均明顯低于正常成人肝組(P<；0.01),而P3和P4 mRNA的表達(dá)水平則都明

11、顯高于正常成人肝組(P<；0.01),PZ mRNA的表達(dá)水平在3組間無顯著性差異(P>；0 .05)。
　　結(jié)論：①肝癌細(xì)胞系和肝癌組織中IGF一H基因Pl、P3和P4啟動(dòng)子常發(fā)生甲基化水平改變,即Pl啟動(dòng)子多出現(xiàn)高甲基化,而P3和P4啟動(dòng)子主要表現(xiàn)為甲基化水平降低；②IGF一H基因5‘調(diào)控區(qū)的這種異常甲基化可能與肝癌中Pl啟動(dòng)子失活和P3、P4啟動(dòng)子再活化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)；③肝癌細(xì)胞系和肝癌組織中工GF一H基因P